Digitale Planimetrie zur Beurteilung der Wundverschlusskinetik in einem Mausmodell

Wunden stellen eine globale gesundheitliche Herausforderung dar. In dieser Studie wurde eine standardisierte Fotokabine mit digitaler Planimetrie entwickelt, um die Variabilität der Wundmessung zu minimieren. Die Überwachung der Wunden bei Mäusen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine anfängliche Zunahme der Wundfläche und des Wundumfangs, gefolgt von einem allmählichen Verschluss. Diese Methodik kann bei der Bewertung der Wundverschlusskinetik in präklinischen Modellen hilfreich sein.

Chronische Wunden sind aufgrund ihrer hohen Prävalenz ein ernstes globales Gesundheitsproblem. Wirksame Therapiestrategien können die Heilung deutlich beschleunigen und damit das Risiko von Komplikationen verringern und die Gesundheitssysteme wirtschaftlich entlasten. Obwohl zahlreiche experimentelle Studien die Wundheilung untersucht haben, stützen sich die meisten auf qualitative Beobachtungen oder quantitative direkte Messungen. Ziel dieser Studie war es, eine indirekte Wundmessmethode mittels digitaler Planimetrie unter Einbeziehung digitaler Skalierung und Segmentierung zu standardisieren. Dieser Ansatz behebt den Mangel an detaillierten Schritt-für-Schritt-Methoden für eine genaue Wundbewertung. Es wurde eine Fotodokumentationskabine entworfen und gebaut, und computergestützte digitale Planimetrie-Tools wurden eingesetzt, um die Variabilität bei der Messung des Wundbereichs, des Umfangs und des Abstands von der Wundmitte zu ihren Rändern zu minimieren. Bei männlichen CD1-Mäusen (n = 4, 10 Wochen alt, 30-35 g) wurde eine kreisförmige traumatische Wunde (5 mm Durchmesser) an der dorsalen Mittellinie auf Höhe des Schulterblatts erzeugt. Die Entwicklung der Wunde wurde 14 Tage lang mit der speziell angefertigten Fotokabine fotografdokumentiert, die die Lichtverhältnisse, die Brennweite und die Positionierung des Motivs steuerte. Skalierungs- und Wundmessungen wurden durch Segmentierung in der ImageJ-Software durchgeführt, und die statistische Analyse wurde mit der statistischen Analysesoftware durchgeführt. Die Kinetik des Wundverschlusses zeigte eine leichte Zunahme der Wundgröße und des Wundumfangs zwischen Tag 0 und Tag 2, gefolgt von einer allmählichen Abnahme bis zum vollständigen Verschluss am Tag 14. Die Fotodokumentationskabine und die computergestützte digitale Planimetrie ermöglichten quantitative Messungen mit minimaler Variabilität. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Werkzeuge eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Bewertung der Wundverschlusskinetik in präklinischen Modellen bieten.

Die traumatische Wundheilung dauert etwa 21 Tage und besteht aus einer genau definierten Abfolge von vier verschiedenen Phasen: (1) Hämostase, (2) Entzündung, (3) Proliferation und (4) Umbau¹. Wenn eine Phase der Wundheilung verlängert wird, kann dies zur Entwicklung chronischer Wunden^{führen 1}. Aufgrund ihrer hohen Prävalenz, ihrer potenziellen Komplikationen² und ihrer erheblichen wirtschaftlichen Belastung gelten sie als globales Gesundheitsproblem.

Präklinische Studien zielen darauf ab, eine schnellere Heilung zu erreichen, indem sie eine umfassende Wundreepithelisierung^{fördern 3,4,5}, Komplikationen verhindern und die Behandlungskosten senken. Diese Studien bewerten verschiedene Strategien, einschließlich der Entwicklung von Biomaterialien, pharmakologischen Interventionen und anderen Verfahren der regenerativen Medizin 6,7,8,9.

Für die Untersuchung traumatischer Wunden wurden mehrere experimentelle Modelle entwickelt. Einige konzentrieren sich auf makroskopisch sichtbare qualitative Merkmale wie Größe, Entzündungsindikatoren, Vorhandensein von Granulationsgewebe, Sekreten und Schorfbildung⁵. Andere analysieren quantitative Daten, einschließlich Fläche, Umfang, Radius, Durchmesser, Farbe, Tiefe und Abstände von der Mitte bis zu den Rändern von Wunden.

In diesem Zusammenhang wird bei den meisten in vivo-Untersuchungen der Wundradius und -tiefe direkt gemessen. Die manuelle Abgrenzung von Wundkanten in einem makroskopischen Bild kann jedoch zu Verzerrungen bei der Messung^{führen 10}. Andere Studien verwenden mechanische Planimetrie unter Verwendung transparenter gerasterter Kunststoffplatten, bei denen die Wundränder zuvor abgegrenzt wurden; In beiden Fällen sind für die Ermittlung der Fläche oder des Umfangs manuelle Instrumente wie Lineale oder digitale Planimeter erforderlich. Heutzutage ermöglicht die computergestützte digitale Planimetrie die computergestützte Analyse von makroskopischen Bildern von Wunden oder Kunststoffplatten. Die In-situ-Manipulation und die Qualität des makroskopischen Bildes stellen eine Einschränkung dar, jedoch reduziert dieses Werkzeug 11,12,13,14 die Variabilität zwischen Flächen- und Umfangsmessungen erheblich.

Diese vorgeschlagene Methodik bietet signifikante Vorteile gegenüber bestehenden Techniken zur Bewertung des Wundverschlusses bei Mäusen 15,16,17,18,19,20. Während die Fotodokumentation als genaues und konsistentes Instrument zur Beurteilung der Wundverschlusskinetik angesehen wurde, haben frühere Studien^21,22 die Grenzen der manuellen Wundmessung hervorgehoben, wie z. B. die Verzerrung des Beobachters und die Variabilität aufgrund inkonsistenter Beleuchtung und Kamerapositionierung. Der aktuelle Ansatz löst diese Probleme, indem er die Bildgebungsbedingungen durch eine speziell angefertigte Kabine standardisiert und so die Reproduzierbarkeit und Präzision verbessert. Darüber hinaus ermöglicht die computergestützte digitale Planimetrie genauere quantitative Bewertungen, verbessert die Bewertung therapeutischer Interventionen und minimiert Messfehler, wie in anderen Studien zum Vergleich manueller und digitaler Techniken gezeigt^{wurde 12,22}, wodurch sie sich besonders für Studien zur Wundverschlusskinetik in Mausmodellen eignet und eine präzise Bewertung von Behandlungen ermöglicht, indem eine strenge Kontrolle über die Bildaufnahmebedingungen beibehalten wird.

Alle Versuchsverfahren mit Labormäusen wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards und Vorschriften durchgeführt, die im offiziellen mexikanischen Standard (NOM-062-ZOO-1999) für den Umgang und die Pflege von Labortieren festgelegt sind. Das Protokoll wurde vom Internen Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Labortieren (CICUAL) des Nationalen Instituts für Kernforschung (ININ) unter der Referenznummer CICUAL-01-23 geprüft und genehmigt. In dieser Studie wurden männliche CD1-Mäuse (n = 4) im Alter von 10 Wochen mit einem Körpergewicht von 28-32 g verwendet. Alle Tiere wurden so ausgewählt, dass sie in Bezug auf Stamm, Alter, Geschlecht und Körpergewicht einheitlich waren und die Variabilität der Versuchsergebnisse minimiert wurde. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bau einer Fotokabine für die Aufnahme von makroskopischen Bildern

HINWEIS: Für die Konstruktion einer Fotokabine wurde die lizenzierte SolidWorks Software (Version 2015) verwendet, um externe Lichtquellen zu eliminieren. Ein 40 cm × 40 cm großer Würfel wurde aus einem ein Zoll dicken weißen Aluminiumprofil konstruiert. Der Kubus bestand aus drei Abschnitten, die nacheinander zusammengesetzt wurden: dem Dach, den Seitenwänden und dem Boden (Abbildung 1A).

1. Dachkonstruktion
   HINWEIS: Das Dach wurde zur Ausrichtung als Vorderkante (A), Hinterkante (B) und Seitenkanten (C und D) regionalisiert (Abbildung 1B).
   1. Befestigen Sie im inneren Bereich der Seitenkante des Daches (C und D) ein geschlitztes Aluminiumprofil (für die Aufnahme von Glas) mit einer Breite, einer Dicke von 2,51 cm und einer Länge von 34,9 cm (Abbildung 1B).
   2. Platzieren Sie zwei 34,5 cm lange x 13 cm breite rechteckige Aluminiumplatten mit Polyethylen in der Mitte in der Nut jedes Dachprofils (Platte 1 und 2 in Abbildung 1C), um das Durchgleiten durch die Nut beider Profile zu ermöglichen.
   3. Installieren Sie eine 20 cm RGB-LED-Rohrleuchte mit einem Farbtemperaturbereich von 2500-9000 K (Abbildung 1C) in einem Winkel von 45° mit doppelseitigem Klebeband an der Unterkante von Panel 1.
   4. Montieren Sie auf den Dachpaneelen 1 und 2 eine 32 cm x 12 cm große rechteckige Schaumstoffplatte mit einem zentralen kreisförmigen Ausschnitt mit einem Durchmesser von 7,82 cm, um die Installation des Kameraobjektivs zu ermöglichen (Abbildung 1C).
2. Aufbau des Fußbodens
   1. Legen Sie ein 40 cm x 40 cm großes quadratisches Stück weiße Schaumstoffplatte auf die Bodenflächenprofile. Schneiden Sie aus jeder Ecke der Schaumstoffplatte Quadrate mit einer Seitenlänge von 2,54 cm aus (Abbildung 1E).
3. Aufbau von Seitenwänden
   1. Schneiden Sie vier viereckige Schaumstoffplatten von 40 cm x 40 cm zu.
   2. Kleben Sie zwei Paneele an den Seiten C und D mit Silikon zusammen, um die linke und rechte Seitenwand zu bilden (Abbildung 1F).
   3. Befestigen Sie Klettverschlüsse an den Aluminiumprofilen A und B, um die internen Elemente der Fotokabine einfach zu bearbeiten. Befestigen Sie zusätzlich 1 cm vom Rand einer Reihe von Klebebefestigungen entfernt an zwei Schaumstoffpappquadraten auf einer Seite und platzieren Sie sie an der Vorder- und Rückwand (Abbildung 1F).
4. Aufbau der Referenzbasis
   HINWEIS: Eine Referenzbasis war erforderlich, um die Maus während der Anästhesie und während der gesamten Dokumentation der Wundentwicklung in Bauchlage zu halten. 3D-Komponenten wurden unter Verwendung der Fused Deposition Modeling (FDM)-Technik mit PLA-Material und einem 3D-Drucker entworfen und hergestellt^23,24.
   1. Drucken Sie die Maske in 3D mit einer Basis von 2 cm in Breite, Länge und Höhe und platzieren Sie sie 11,5 cm vom Rand eines vorgeschnittenen 40 cm x 28 cm großen Rechtecks aus weißer Schaumstoffplatte, um die Mäuse unter Inhalationsnarkose zu halten (Abbildung 1D, rote Farbe).
   2. Drucken Sie die rechteckige Plattform (9 cm lang, 5 cm breit, 2,5 cm hoch) mit vier extrudierten Bereichen, um den Mausrücken während der Bildaufnahme auszurichten. Diese Bereiche stützten den Kopf, die Gliedmaßen und die Bauchregion, um die Bauchlage beizubehalten. Kleben Sie diese Plattform in die Mitte der Referenzbasis (Abbildung 1D, grüne Farbe).
   3. Drucken Sie den Linealblock (2 cm breit, 8 cm lang, 2,5 cm hoch) in 3D und befestigen Sie ihn 1 cm von der linken Seite der Mausbasis entfernt, um das für die digitale Bildverarbeitung benötigte Messreferenzelement zu platzieren (Abbildung 1D, blaue Farbe).
   4. Befestigen Sie ein 15 cm langes Graduiertenlineal aus Edelstahl am Linealblock und installieren Sie die gesamte Referenzbasis in der Kabine für die Bildskalierung (Abbildung 1D).

Abbildung 1: Schema für den Aufbau des makroskopischen Bildaufnahmeschranks. (A) Schnitte der Kabine (Dach, Seitenwände, Boden). (B)Ausrichtung der Profile, die das Dach bilden; vorne (A), hinten (B) und Seiten (Innenseite der Profile in rot "C,D"). (C) Dachpaneele 1 und 2, Installation des LED-Lichtrohrs, der Kameraobjektivplatte und der Bodeninstallation. (D) Installation der Anästhesiemaske (ROT), der Mausplattform (GRÜN) und der rechteckigen Plattform zur Positionierung des Messlineals (BLAU) auf der Referenzbasis. (E) Endgültige Position für die Referenzbasis. (F) Montage von Seiten-, Vorder- und Rückwänden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Erhaltung der Tiere

1. Holen Sie die Genehmigung der Bioethikkommission der Institution für Tierversuche ein. Verwenden Sie CD1-Mäuse (n = 4), 10 Wochen alt und mit einem Gewicht von 28-32 g.
2. Halten Sie die Mäuse unter Standardbedingungen unter: Halten Sie eine Temperatur von 21 °C aufrecht, 12/12 h Hell-Dunkel-Zyklen, 45 % Luftfeuchtigkeit und ermöglichen Sie ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung, außer während Fotodokumentationssitzungen.

3. Traumatische Wundentstehung

1. Fasten Sie die Mäuse 8 Stunden vor dem Eingriff. Betäuben Sie die Mäuse mit intraperitonealem Natrium-Pentobarbital in einer Dosis von 65 mg/kg²⁵ (nach institutionell anerkannten Protokollen).
   1. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie während einer interdigitalen Klemme auf einen fehlenden Entzugsreflex prüfen. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern. Halten Sie die Mäuse während der Operation und der Genesung (20 min) auf einer stabilen Temperatur von 37 °C.
2. Bringen Sie die Maus in eine ventrale Dekubitusposition und enthaaren Sie einen 2,5 cm x 3 cm großen Bereich von der Halsregion kaudal mit chirurgischen Klingen. Dehnen Sie die Haut, um Schnittwunden zu vermeiden. Führen Sie Asepsis und Antisepsis mit abwechselnd Povidon-Jod- und sterilen Wasserspülungen durch.
3. Verwenden Sie einen sterilen 5-mm-Biopsiestanzer und üben Sie mit kreisenden Bewegungen Druck aus, um einen dermo-epidermalen Schnitt auf Höhe des Schulterblatts zu erstellen. Entfernen Sie die Klappe mit einer gezackten Pinzette und schneiden Sie sie mit einer Iris-Schere (Abbildung 2A).
4. Im Falle des Vorhandenseins von Blutungspunkten in der Wunde wenden Sie einen Elektroschock mit einem Elektrokautergerät an, um eine Blutstillung zu erreichen.
5. Legen Sie mit einer Juwelierzange einen kreisförmigen Hautfilm mit einem Durchmesser von 1 cm über die Wunde, um eine Kontamination und Kontraktion zu verhindern.
6. Führen Sie alle Überlebensoperationen unter sterilen Bedingungen durch. Bereiten Sie das Operationsfeld mit Desinfektionsmitteln wie Povidon-Jod vor. Tragen Sie sterile Handschuhe und eine Maske und halten Sie die Sterilität während des gesamten Eingriffs aufrecht, indem Sie sterile Instrumente verwenden und den Kontakt mit unsterilen Oberflächen minimieren.
   1. Setzen Sie die Mäuse nach der Operation in einzelne Käfige bei 24 °C und überwachen Sie sie, bis sie wieder genügend Bewusstsein haben, um die sternale Position beizubehalten. Stellen Sie sicher, dass die Körpertemperatur während und nach der Operation kontrolliert wird, um eine Unterkühlung durch die Verwendung externer Wärmequellen zu vermeiden.
7. Verabreichen Sie die Analgesie bis zum 4. Tag, indem Sie Ketorolac im Trinkwasser auf 5 mg/kg²⁶ verdünnen.
8. Nach 14 Tagen, wenn die Wunden bei gesunden Nagetieren in der Regel fortgeschrittene Stadien der Heilung erreichen, euthanasieren Sie die Mäuse durch_O2-Ersatz in einer CO₂ -Kammer nach internationalen Standards. Dies markiert den Endpunkt der Studie.

4. Makroskopische Bilderfassung

1. Nehmen Sie täglich Bilder der Wunden an 14 aufeinanderfolgenden Tagen auf, um die kontinuierliche Kinetik des Wundverschlusses zu überwachen. Verwenden Sie eine semiprofessionelle oder professionelle Kamera; Positionieren Sie das Objektiv durch die kreisförmige Öffnung im Dach der Fotokabine.
   HINWEIS: Passen Sie den Zeitplan je nach Versuchsbedingungen nach Bedarf an.
2. Verwenden Sie eine RGB-LED-Lichtröhre im CCT-Modus (Correlated Colour Temperature), der auf 9000 K und 100 % Helligkeit für die Beleuchtung eingestellt ist.
3. Positionieren Sie die Referenzbasis in der Mitte des Bodens der Fotokabine.
4. Legen Sie die Maus für 3 Minuten in die Inhalationsanästhesiekammer (Abbildung 2B).
5. Platzieren Sie die Maus nach Einleitung der Anästhesie in Bauchlage auf der Mausplattform. Befestigen Sie die Schnauze in der Sevofluran-Anästhesiemaske und geben Sie 5 % Sevofluran bei einer Sauerstoffflussrate von 1,5 l/min ab (Abbildung 2C).
6. Entfernen Sie vor der Aufnahme von Bildern den Hautfilm mit einer Jeweller-Pinzette von der Wunde und richten Sie die Referenzbasis mit dem Kameraobjektiv aus.
7. Installieren Sie die Vorderwand der Fotokabine und nehmen Sie makroskopische Bilder mit den folgenden Einstellungen auf: Blende f/3.2, Belichtungszeit 1/200 s, ISO-Empfindlichkeit 80, Brennweite 4 mm.
8. Legen Sie mit einer Jeweller-Pinzette einen Hautfilm mit einem Durchmesser von 1 cm auf die Wunde, bevor Sie die Anästhesiemaske entfernen. Bringen Sie die Mäuse in einzelne Käfige und beobachten Sie, bis sich der Motor erholt hat.

5. Bildverarbeitung

1. Generieren Sie eine Sicherungskopie der makroskopischen Bilder. Verarbeiten Sie die Bilder mit der ImageJ-Software.
2. Öffnen Sie das Backup-Image in ImageJ, indem Sie dem Pfad folgen: Datei > Öffnen > Suchen Sie in den Bildern und klicken Sie dann auf Öffnen.
3. Skalieren Sie das Bild nach Referenz: Maximieren Sie das Bild, wählen Sie das geradlinige Werkzeug aus, vergrößern Sie das Lineal neben der Maus mit der Taste +, zeichnen Sie eine gerade Linie von 10 mm auf das Linealbild, gehen Sie dann zu Analysieren > Maßstab einstellen > geben Sie "10" für Bekannte Entfernung ein > Längeneinheit auf mm festlegen und klicken Sie dann auf OK. Dadurch wird das Pixel-zu-Entfernungs-Verhältnis für das makroskopische Bild bestimmt (Abbildung 2D).
4. Wundbereich vom Bild trennen: Wähle mit dem Rechteckwerkzeug den Bereich um die Wunde aus (b = 150, h = 150). Notieren Sie die X- und Y-Werte, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Rechteck > Duplizieren > benennen Sie das Motiv > drücken Sie die Eingabetaste. Drücken Sie im neuen Bild zweimal +, um die Ansicht zu vergrößern (Abbildung 2E).
5. Speichern Sie das zugeschnittene Bild, indem Sie dem Pfad folgen: Datei > Speichern unter > Tiff > Geben Sie den Namen ein > Speichern.
6. Erstellen Sie ein Duplikat des zugeschnittenen Bildes, um Änderungen während der Segmentierung zu vermeiden: Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das zugeschnittene Bild > Duplizieren > benennen Sie es, indem Sie am Ende "Segmentierung" hinzufügen. Drücken Sie anschließend die Eingabetaste. Drücken Sie im neuen Bild zweimal +, um die Ansicht zu vergrößern.
7. Unterteilen Sie das Bild in Farbkanäle, indem Sie diesem Pfad folgen: Bild > Typ > RGB-Stapel. Klicken Sie im roten Kanalbild (1/3 Rot) mit der rechten Maustaste auf Duplizieren und drücken Sie OK im Duplizieren-Fenster.
8. Segmentieren Sie das Bild des roten Kanals. Klicken Sie auf das rote Kanalbild, Bild > > Schwellenwert anpassen. Wählen Sie anschließend Standard > Apply (Standard) aus (Abbildung 2F).
9. Korrigieren Sie den Region of Interest (ROI), um eine vollständige Wundabdeckung zu gewährleisten und Segmentierungsverzerrungen zu vermeiden.
   HINWEIS: Wenn Bereiche um die Wunde herum nicht in die Segmentierung einbezogen werden, gehen Sie zu Prozess > Binär- > Fülllöchern. Um schwarze Punkte außerhalb der Wunde zu entfernen, gehen Sie zu Prozess > Binäres > Erodieren. Wenn der Befehl "Erodieren" die Wundgröße verringert, korrigieren Sie sie mit > "Binär verarbeiten" > "Dilatieren".
10. Markieren Sie den Umfang des ROI: Bearbeiten > Auswahl > Auswahl erstellen. Der ROI wird gelb umrandet. Fügen Sie es dem ROI-Manager hinzu, indem Sie > Auswahl bearbeiten > Zum Manager hinzufügen folgen (Abbildung 2G).
11. Validieren der Segmentierung: Öffnen Sie das Fenster ROI-Manager und wählen Sie den ROI aus, den Sie überprüfen möchten: Mehr > Übersetzen. Geben Sie die in Schritt 4 aufgezeichneten X- und Y-Werte ein, und drücken Sie OK.
    1. Maximieren Sie das Originalbild und wählen Sie dann den ROI im ROI-Manager aus. Passen Sie den ROI mit den Pfeiltasten an, bis er mit der Wunde ausgerichtet ist (Abbildung 2H). Wenn der ROI mit der Wunde übereinstimmt, war die Segmentierung erfolgreich. Andernfalls wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 2.
12. Sobald die Segmentierung bestätigt ist, erhalten Sie die Wundmessungen: Analysieren > Messen. In einer Ergebnistabelle werden die Werte für Fläche, Umfang und X/Y-Position angezeigt. Kopieren Sie diese Werte zur Dokumentation und statistischen Analyse in die SPSS-Software (Abbildung 2I).

Abbildung 2: Arbeitsablauf der Wundmessung mittels digitaler Planimetrie und Segmentierungstechniken. (A) Dermo-epidermale Inzision mit einem sterilen 5-mm-Biopsiestanzer. (B) Platzieren der Maus in einer inhalativen Anästhesiekammer für 3 Minuten. (C) Fotodokumentation durch Positionieren der anästhesierten Maus in der Fotokabine und Befestigen der Schnauze in einer Sevofluran-Maske. (D) Öffnen Sie das erhaltene Bild in ImageJ und skalieren Sie es mit dem Lineal als Referenz. (E) Extrahieren des Wundbereichs mit dem Rechteckwerkzeug. (F) Aufteilen des Bildes in RGB-Kanäle und Verarbeiten des Rotkanals. (G) Skizzierung und Verwaltung der Region of Interest (ROI). (H) Validierung der Segmentierung, indem der ROI mit der Wunde abgeglichen wird. (I) Messung der Wundparameter und Aufzeichnung der Ergebnisse für die statistische Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Sterbehilfe nach dem Verfahren

HINWEIS: Die Studie endet nach 14 Tagen, zu diesem Zeitpunkt erreichen die Wunden bei gesunden Nagetieren in der Regel fortgeschrittene Stadien der Heilung. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Mäuse nach dem etablierten institutionell anerkannten Euthanasieverfahren human eingeschläfert.

1. Bereiten Sie die Ausrüstung vor. Stellen Sie sicher, dass die Euthanasiekammer sauber, trocken und von angemessener Größe ist, um die Mäuse ohne Überfüllung unterzubringen. Schließen Sie die Kammer an eine medizinische CO₂ -Versorgung mit einem Durchflussregler an.
2. Bringen Sie die Mäuse vorsichtig in die Kammer, um den Stress zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass sie sich in einer ruhigen Umgebung mit minimalen äußeren Störungen befinden.
3. Stellen Sie die CO_{2 -}Durchflussrate auf 20 % bis 30 % des Kammervolumens pro Minute ein, wie in den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren empfohlen. Erhöhen Sie allmählich die CO₂ -Konzentration, um Stress oder Unbehagen bei den Mäusen zu vermeiden.
4. Beobachten Sie die Mäuse während des Eingriffs genau. Achten Sie auf Anzeichen eines allmählichen Bewusstseinsverlusts, einschließlich verminderter Aktivität und Atmung, gefolgt von Apnoe und Herzstillstand.
5. Bestätigen Sie den Tod, sobald die Mäuse nicht mehr atmen und keine Anzeichen von Bewegung zeigen. Warten Sie weitere 1-2 Minuten, um eine vollständige Beendigung der Vitalfunktionen zu gewährleisten. Überprüfen Sie den Tod, indem Sie das Fehlen von Reflexen (z. B. Hornhautreflex) und Herzaktivität bestätigen.
6. Füllen Sie die Schlachtkörper in dafür vorgesehene Behälter für biologische Sonderabfälle um. Befolgen Sie die institutionellen Protokolle und nationalen Richtlinien für die sichere Entsorgung von Tierresten.
7. Notieren Sie die Anzahl der eingeschläferten Tiere, das Datum und alle relevanten Beobachtungen, um die Einhaltung ethischer und institutioneller Standards sicherzustellen.

Nach dem Skalieren der Bilder in der ImageJ-Software wurden der durchschnittliche Umfang (Tabelle 1) und die Fläche (Tabelle 2) der Wunden zusammen mit ihren jeweiligen Standardabweichungen durch digitale Segmentierung ermittelt. Diese Werte wurden vom Tag Null bis zum vierzehnten Tag (D0-D14) aufgezeichnet.

Tabelle 1: Perimetermessungen von Wunden (Tage 0-14). Die Werte stellen die Messungen des Wundumfangs (mm) pro Tag (D_0-14) als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar.

Tabelle 2: Flächenmessungen von Wunden (Tage 0-14). Die Werte zeigen die Messungen der Wundfläche (mm²) pro Tag (D_0-14) als Mittelwert ± Standardabweichung (SD).

Die Wundfläche und der Wundumfang nahmen zunächst von Tag 0 bis Tag 3 zu, was auf eine Entzündungsreaktion hindeutet, die die Wundgröße vorübergehend über ihre ursprünglichen Maße hinaus vergrößerte. Von Tag 3 bis Tag 6 nahmen jedoch sowohl die Fläche als auch der Umfang allmählich ab, wobei an Tag 7 eine signifikante Verringerung zu beobachten war. Zu diesem Zeitpunkt waren die Wunden kleiner als ihre ursprüngliche Größe, was auf eine fortgeschrittene Heilung hindeutet.

Um die Kinetik des Wundverschlusses zu untersuchen, wurden Flächendaten verwendet, um den prozentualen Anteil der Wundheilung mit der Robson-Gleichung^27,28 (Gleichung 1) zu berechnen:

wobei %Δ A der prozentualen Verringerung der Wundfläche am Tag der Bewertung ( _{Flächentag x}) gegenüber der ursprünglichen Fläche am Tag Null (_{Flächentag 0}) entspricht.

Tabelle 3: Prozentsatz des Wundverschlusses (Robson-Gleichung). Die Werte stellen die mittleren Prozentsätze der Wundflächenreduktion dar, die nach der Robson-Gleichung (Gleichung 1) als mittlere ± Standardabweichung (SD) berechnet werden.

Wenn die aus dieser Gleichung erhaltenen Prozentsätze positiv sind (Tabelle 3), deuten sie auf einen Wundverschluss hin, während negative Werte auf eine Zunahme der Wundgröße hinweisen (Abbildung 3A). Zur Berechnung des Rückzugsabstands von den gewickelten Kanten zur Mitte wurden Flächen- und Umfangsdaten mit der Gilmam-Gleichung^29,30,31 (Gleichung 2) verwendet:

Dabei ist D der durchschnittliche lineare Vorschubabstand in mm von den Rändern zur Wundmitte, A₀ ist die Wundfläche zu Beginn der Behandlung (Tag₀), A_i ist die Wundfläche zum Zeitpunkt der Messung, P₀ ist der Umfang der Wunde zu Beginn (Tag₀), P_i t dem Umfang zum Zeitpunkt der Messung.

Tabelle 4: Retraktion der Wundränder (Gilmam-Gleichung). Die Werte zeigen chronologisch die durchschnittliche Retraktion (mm) vom Wundrand bis zur Wundmitte, dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD).

Passend zu den prozentualen Wundverschlüssen zeigen positive Werte aus Gleichung 2 , dass die Wundränder näher zusammenrücken, was auf eine Kontraktion hinweist (Tabelle 4). Umgekehrt spiegeln negative Werte eine Vergrößerung dieser Entfernung wider (Abbildung 3B). Anfangs, am Tag 0, betrug der Wunddurchmesser 5 mm, woraus sich 2,5 mm ± 0,0425 mm vom Rand zur Mitte ergaben. Diese Anfangsdistanz diente als Grundlage für die Berechnung der durchschnittlichen täglichen Wundretraktionsrate. Die berechnete Retraktionsrate wurde dann von der anfänglichen Distanz subtrahiert, um die in Tabelle 5 dargestellte synthetische Wundverschlussrate zu erzeugen.

Tabelle 5: Wundverschlussrate (mm). Die Werte zeigen die Wundretraktion im Laufe der Zeit. Dies erhält man, indem der Abstand von der Wickelkante zu jedem Zeitpunkt vom Anfangsabstand (2,5 mm ± 0,0425) als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) subtrahiert wird.

Der Prozentsatz des Verschlusses wurde unter Verwendung der Robson-Gleichung³² (Abbildung 3A) berechnet, die häufig bei sequentiellen Messungen des Ulkusverschlusses bei diabetischer Neuropathie verwendet wird, und Gillmans Gleichung³³ (Abbildung 3B) wird häufig verwendet, um den Fortschritt der Wundheilung zu überwachen.

An Tag 0 zeigte die anfängliche Operationswunde (5 mm Durchmesser, dargestellt als 100%) einen signifikanten Anstieg auf 138,04% an Tag 2, wahrscheinlich aufgrund des anfänglichen Entzündungsprozesses um die Wunde ^4,34. Während dieser Zeit wandern Neutrophile und Makrophagen und setzen Zytokine und Wachstumsfaktoren frei²⁸. Die Entzündungsphase dauert in der Regel ein bis drei Tage³⁵. Dennoch kann es sich bei ausgedehnten Verletzungen, zusätzlichen Infektionen, Vorerkrankungen oder bei älteren Erwachsenen, bei denen Reparaturmechanismen verzögert sind, über mehrere Wochen erstrecken.

Diese Ergebnisse unterstreichen die Wirksamkeit dieser Methodik, die den Einsatz der Fotokabine, der digitalen Segmentierung und der digitalen Planimetrie kombiniert, um die dynamischen Veränderungen der Wundverschlusskinetik genau zu erfassen. In diesem Modell führte die Entzündung wahrscheinlich zu einer Retraktion des Wundrands, was zu einer anfänglichen Vergrößerung der Wundfläche und des Wundumfangs führte. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die optimalen Lichtbedingungen für die makroskopische Bildgebung mit einer RGB-LED-Lichtröhre im CCT-Modus bei 9000 K und 100 % Intensität erreicht wurden, wobei der ideale Kameraabstand auf 18 cm zur Maus eingestellt war.

Abbildung 3: Kinetik der Wundheilung. (A) Der prozentuale Anteil des Wundverschlusses, der anhand der Robson-Gleichung berechnet wird. (B) Anzeige der Heilungsrate über die 14-tägige Evolutionsperiode, wie sie durch die Gillman-Gleichung bestimmt wird. Negative Werte in beiden Gleichungen deuten auf eine Zunahme der Wundgröße hin, während positive Werte mit einem Wundverschluss verbunden sind. Beide Felder stellen die Heilungskinetik dar, wobei die Standardabweichungen (SD) durch Fehlerbalken neben Fotos dargestellt werden, die die Wundentwicklung über 14 Tage (D_0-14) veranschaulichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Abbildung 3A zeigt den prozentualen Anteil des Wundverschlusses, der anhand der Robson-Gleichung berechnet wurde, und Abbildung 3B zeigt die Heilungsrate über die 14-tägige Entwicklungsperiode, wie sie durch die Gillman-Gleichung³³ bestimmt wird.

In präklinischen Modellen steht die quantitative Analyse der Entwicklung traumatischer Wunden in präklinischen Modellen vor Herausforderungen aufgrund von Faktoren wie Wundgröße, lokalisierte Entzündungsreaktion³⁴, Lokalisation und/oder Manipulation. Für diese Messungen gibt es direkte manuelle³⁶ und indirekte digitale^11,16,37,38 Planimetriemethoden. Im Gegensatz zu Studien mit manuellen Methoden, die oft unter Beobachterverzerrungen und Variabilität der Lichtverhältnisse leiden, wurde in unserer Studie eine standardisierte digitale Planimetrie verwendet. Studien, die manuelle Messungen verwendeten, berichten von einer höheren Variabilität der Wundgröße^10,38, während unsere Technik eine größere Konsistenz im Laufe der Zeit zeigte. Darüber hinaus führte dieses kontrollierte Beleuchtungs- und Positionierungssystem im Vergleich zu anderen digitalen Methoden 11,16,37,38 zu genaueren Messungen.

Der Mangel an detaillierten Schritt-für-Schritt-Methoden zur Messung der Wundfläche und des Wundumfangs führte zur Entwicklung einer standardisierten indirekten Messmethode unter Verwendung digitaler Planimetrie, Skalierung und Segmentierung. Um dies zu erreichen, wurde eine Fotodokumentationskabine konzipiert und gebaut. Durch die Steuerung der Lichtverhältnisse, der Motivpositionierung und des Kameraabstands wurde die Konsistenz der makroskopischen Bildaufnahme sichergestellt und die Verzerrung bei den Wundmessungen minimiert. Studien an Nagetieren haben über einen kontinuierlichen Wundverschluss vom Tag Null an berichtet, der auf die Verwendung von Silikonringen um die Läsionen während des chirurgischen Eingriffs zurückzuführen ist^39,16, was möglicherweise das Zurückziehen und Ausdehnen der Wunde während der Entzündung verhindert. Umgekehrt berichtete eine andere Studie, in der künstliche Dermisprodukte mit dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) untersucht wurden, über eine Zunahme der Wundfläche und des Wundumfangs²⁰.

Die Wundheilung umfasst vier aufeinanderfolgende Phasen: Blutstillung (1-24 h)⁴⁰, Entzündung (1-3 Tage)⁴¹, Proliferation (3-21 Tage)³⁴ und Konsolidierung (21-60 Tage)⁴, obwohl sich diese überlappen können ^4,34. In dieser Studie schritt die Entzündung subjektiv von Tag 3 bis 6 fort und ging in die proliferative Phase über.

Diese Übergangsphase ist entscheidend für die Heilung, da sie die Entzündungsreaktion reduziert, indem sie die Neutrophilen verringert und die Makrophagen³² erhöht, die Angiogenese⁴², die Kollagensynthese und die Aktivierung der Fibroblasten fördert. Fibroblasten wandern zur Wundstelle, initiieren die extrazelluläre Matrixsynthese und lagern Fibronektin³⁴, Kollagen, Proteoglykane, Hyaluronsäure und Glykosaminoglykane ab, die für das Gerüst und die anschließende Zelladhäsion unerlässlich sind⁴³. Von Tag 2 bis 6 zeigte dieses Modell eine Verringerung der Wundgröße von 138,04 % auf 108,21 %, was auf eine verminderte Entzündung hindeutet.

Trotz der anfänglichen Zunahme der Wundgröße kehrte sich dieser Trend ab dem siebten Tag um und erreichte 86,23 % und heilte allmählich bis zum 14. Tag. Dies entspricht wahrscheinlich der proliferativen Phase⁴⁴ und dem Beginn der Angiogenese⁴⁵, wobei Granulationsgewebe gebildet wird, das die Wunde zusammenzieht, wie in dieser Studie beobachtet. Ähnliche kontinuierliche Verschlussmuster wurden in Nagetierstudien berichtet ^6,19, was darauf hindeutet, dass Wunden unabhängig von klinischen Eingriffen heilen, mit Unterschieden in der Verschlussgeschwindigkeit. Somit könnte dieses Modell als Referenzkontrolle dienen.

Der Wundverschluss verlangsamte sich von Tag 9 bis 14 und erreichte schließlich 6,60 %. Bemerkenswert ist, dass sich ab Tag 4 Krusten über den Wunden bildeten, der sich an Tag 10 von den Rändern löste, kleine Bereiche von Narbengewebe darunter freilegte und sich am vierzehnten Tag vollständig ablöste.

Es ist wichtig zu beachten, dass eine makroskopisch geschlossene Wunde signifikante mikroskopische Unterschiede aufweisen kann, die eine detaillierte histologische Analyse erforderlich machen, um die zelluläre Morphologie und die Wundentwicklung zu beobachten. Diese Methodik ermöglicht präzise Flächen- und Umfangsdaten mit minimaler Variabilität und erleichtert die Verwendung mathematischer Gleichungen bei der Analyse der Wundverschlusskinetik. Das mathematische Verhalten, das in den Ergebnissen beobachtet wurde, die mit den Gleichungen³³ (Abbildung 3B) und³² (3A) von Gillman berechnet wurden, war konsistent.

Kritische Schritte des Protokolls
Obwohl Wunden typischerweise eine Plasmatranssudation zur äußeren Umgebung aufweisen, kontrollierte diese Studie bestimmte Faktoren, die auch die Wundheilungsmechanismen beeinflussen könnten. In früheren Studien wurde beobachtet, dass die richtige Blutstillung die Interaktion zwischen der Wunde und dem Hautfilm fördert, da übermäßige Blutungen die Wundgeometrie und die Schorfgröße verändern.

Modifikationen und Fehlerbehebung
Die vorgeschlagene Methodik ermöglicht die Generierung von Mausmodellen mit größeren und tieferen Wunden. Wenn jedoch die Wundposition geändert wird, muss die Referenzbasis neu positioniert werden, um sicherzustellen, dass sie im makroskopischen Bild zentriert bleibt. Zusätzlich können die Tage für die Fotodokumentation und die Dauer des Modells angepasst werden.

Begrenzungen
Zu den Einschränkungen dieser Methode gehört die Größe der Fotodokumentationskabine, die für kleine, leichte Nagetiere ausgelegt ist. Mit Modifikationen an der Mausbasis könnte sie jedoch für größere Nagetiere angepasst werden. Darüber hinaus misst diese Methode derzeit keine extensionalen traumatischen Wunden durch Segmentierung, obwohl sie mit weiteren Modifikationen angewendet werden kann.

Bedeutung der Methode im Vergleich zu bestehenden/alternativen Methoden
Verschiedene Methoden zur Wundmessung verwenden die digitale Planimetrie 11,12,13,14. Sie berichten jedoch oft nicht über die Lichtverhältnisse, den Abstand zwischen Kamera und Wunde oder die Wiederholbarkeit der Position der Fotodokumentation über die Tage der Wundentwicklung. Hier ist die aktuelle Studie von Bedeutung.

Bei diesem Modell sorgt die RGB-Lampenkonfiguration für optimale Lichtverhältnisse im Modus Correlated Colour Temperature (CCT) bei 9000 K bei 100 % Helligkeit. Der ideale Abstand zwischen der Mausbasis und dem Kameraobjektiv beträgt 18 cm. Unter diesen Bedingungen konnten wir feststellen, dass der rote Kanal des RGB-Stacks den gewickelten Bereich segmentiert, ohne die Ränder des Granulationsgewebes zu erfassen, was bisher nicht berichtet wurde.

In Anbetracht der Tatsache, dass bei einigen Methoden Kameras¹⁶ verwendet werden, die an Geräten wie Stereoskopen montiert sind, die nicht für alle Laboratorien zugänglich sind, bietet diese Fotodokumentationskabine die Möglichkeit, qualitativ hochwertige Bilder für die anschließende Analyse zu erhalten.

Bedeutung und Einsatzmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen
Die potenziellen Anwendungen und die Bedeutung dieser Methodik liegen in ihrer Fähigkeit, Verzerrungen bei Wundmessungen zu beseitigen und zuverlässige Daten für die Verfolgung des Heilungsprozesses zu generieren. Darüber hinaus ermöglicht die Wiederholbarkeit der Mausposition die zukünftige Erstellung eines ImageJ-Makros, das interessante Bereiche automatisch analysiert und abgrenzt. Wenn der Zugang zu einer semiprofessionellen oder professionellen Kamera für hochauflösende Bilder nicht verfügbar ist, kann die Kabine so umgebaut werden, dass mit einer Handykamera fotografiert wird, die eine App verwenden kann, um Fotos ohne automatische Farbkorrektur aufzunehmen.

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Forschung gibt.

Die Autoren danken dem Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT, CVU: 933600) für die Bereitstellung von Mitteln und dem Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (LANIDER-ININ) für ihre Unterstützung. Darüber hinaus wurde Abbildung 2 mit Hilfe der BioRender-Software (2020) erstellt, die unter BioRender.com/p67z056 verfügbar ist.