新药的安全性检测至关重要,该方案描述了如何使用经过验证的标准品来评估 CRS 平台的可重复性、稳健性和潜在局限性。该技术已在 11 个不同的实验室中使用这些试剂进行了验证,并且一项国际合作研究观察到了类似的反应模式,因此提高了协调性和可重复性方面的工作。该技术的应用扩展到改进新型治疗性抗体的 CRS 风险测试,也将有助于为潜在副作用的临床管理做好准备。
这项工作是为了提高可重复性和协调性,而视觉演示提高了可重复性的机会。首先将参比试剂安瓿瓶的内容物溶于一毫升无菌蒸馏水中,并静置 5 至 10 分钟的再水化。然后,在将抗体溶液转移到无菌加盖试管中之前,将其适当混合。
接下来,在无菌 PBS 中将每种重构的抗体和测试抗体稀释至 10 μg/mL。取无菌、未经 TC 处理的 U 形底聚丙烯 96 孔微量滴定板,向板的指定孔中加入 100 μL 所需的稀释抗体溶液。然后,在进行固相测定之前,将板在 4 摄氏度下孵育过夜。
将至少 30 毫升外周血采集到肝素化管中后,将其倒置数次,以确保血液样本与肝素钠正确混合。将 15 毫升全血样品放在单独的试管中,以备稍后在水相全血测定中使用。通过添加等体积的 PBS 或无血清 RPMI 1640 培养基来稀释剩余的 15 mL 全血。
将稀释的血液轻轻地铺在 50 mL 试管中的 15 mL 密度梯度培养基的顶部。使用 500 G 和室温下降低加速度的水平转子将管子离心 20 分钟,以将血液分离成不同的成分。离心后,密度梯度将分离为血浆的顶层,然后是一层含有 PBMC 的薄薄的血沉棕黄层和含有红细胞和多形核粒细胞(包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)的底层。
小心去除上层血浆,然后去除下一层,以收获 PBMC。洗涤时,将收获的血沉棕黄层重悬于 10 毫升 PBS 或无血清 RPMI 1640 培养基中。将试管从 500 G 离心开始 10 分钟以沉淀细胞。
弃去上清液并再次重复洗涤。然后,将所得沉淀重悬于 2 mL 完全 RPMI 培养基中。使用血细胞计数器计数细胞,并在完全 RPMI 中将 PBMC 浓度调节至每毫升 100 万个细胞。
对于水性相全血细胞因子释放测定,取先前放置的全血样品,将 190 μL 样品添加到 96 孔 U 形底聚苯乙烯板的孔中,加入热处理抗体和参比试剂,在 PBS 中预稀释至 100 μg/mL,并将 10 μL 所需稀释抗体添加到含有 190 μL 全血的指定孔中。将板在 37 摄氏度的加湿培养箱中孵育 48 小时。对于固相 PBMC 细胞因子释放测定,获得先前制备的包被板。
使用多通道移液器,丢弃包被板中的抗体溶液。用 PBS 填充试剂储液槽后,用 200 μL PBS 洗涤板 3 次,以去除未结合的单克隆抗体。向每个孔中加入 200 微升先前制备的 PBMC 悬浮液。
将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 48 小时。与对照和检测单克隆抗体孵育 48 小时后,将板以 400 G 离心 5 分钟。收集细胞条件培养基或血浆,而不会干扰细胞沉淀。
将收集的上清液或血浆在零下 20 摄氏度下冷冻。PBMC 固相测定结果表明,与匹配的同种型对照相比,阳性对照抗体诱导的细胞因子水平显著升高。还观察到,抗 CD28 超激动剂诱导的白细胞介素 2 或 IL-2 释放的倍数变化明显高于其匹配的同种型,而抗 CD3 和抗 CD52 在仍诱导 IL-2 表达的同时,导致较低的倍数变化。
在全血水相测定中,可检测细胞因子的水平相对低于固相测定,但其特征是对抗 CD52 刺激的敏感性更高。