使用体外和体内模型分析细胞外囊泡介导的血管钙化

该协议提供了一种可用于帮助评估的方法，并在未来帮助开发血管钙化的治疗方法，血管钙化是心血管疾病最重要的预测指标。分离EV的能力使我们能够进一步研究导致血管钙化的机制，以及血管平滑肌细胞的表型变化。该技术提供了对血管平滑肌细胞介导钙化的早期分子机制的见解。

了解这一点可以研究所理解的机制的治疗选择。任何感兴趣的电动汽车都可以使用这种方法进行研究。它不仅限于血管平滑肌细胞、成骨细胞或血管钙化。

对小鼠实施安乐死后，用镊子提起皮肤，并在中线切开一个切口。去除多余的皮肤或脂肪。然后去除中线外的生殖器官、膀胱和脂肪。

然后将胃肠道器官移到右侧，沿着中线的肠道移动。一旦发现，抬起中线，并将胃肠道切除到胃部。通过将肾脏从中线抬起来切除肾脏。

切得尽可能靠近肾脏。通过抬起肺叶并从中线切开来去除肝脏。然后通过使用10毫升注射器将冷PBS注入右心室来灌注心脏和主动脉。

等待肺部膨胀，然后变白。切除肺部和任何多余的横膈膜或胸腔。要去除骨头，请打开一把宽的剪刀，并将它们放在鼠标尾巴上方的下部区域。

向下切开，从皮肤上抬起脊柱，然后去除中线两侧的脂肪。一旦皮肤脱落，通过在心脏上方切割来切除脊柱和完整的器官。如果运送到立体镜，请将脊柱和完整的器官放在冰桶中的PBS烧杯中。

将脊柱和器官移入解剖盘后，用冰冷的PBS填充，并用针钉住脊柱和胸腔。在解剖显微镜下，用镊子小心地提起心脏，然后开始在脊柱上方和主动脉下方切割。继续此操作，直到到达脊柱底部。

从解剖盘中取出脊柱，并固定心脏和任何多余的脂肪或肌肉。从心脏正下方的区域开始，识别食道、腔静脉和主动脉。切除食道和腔静脉，以获得清晰的主动脉视野。

使用显微解剖钳和剪刀，开始提起脂肪组织，并尽可能靠近主动脉切割。沿着内侧线继续，直到所有主动脉和股动脉都暴露在外。在心脏处，去除所有脂肪组织，露出主动脉弓处的三个分支。

通过将显微夹层剪刀插入左心室并切割主动脉周围的肌肉，从左心室移除主动脉根部。分离并清洁主动脉后，使用近红外扫描仪对主动脉进行成像，以可视化血管钙化。使用自定义 MATLAB 脚本，量化钙示踪剂的总信号，归一化为总扫描主动脉区域。

将 MATLAB 从主动脉的近红外扫描中指向 TIF 文件的位置，打开单个文件，然后从 TIF 文件中提取像素强度值。选择钙化程度最大的主动脉作为彩色映射图像上的最大值。当窗口上出现"图像中有多少个标本"命令时，输入当前图像中的主动脉数量，然后逐个选择每个主动脉。

选择主动脉后，MATLAB 将创建带有主动脉总面积和钙化面积掩码的二进制图像。然后使用这些遮罩图像的值来确定总钙化面积、主动脉总面积、钙化阳性面积百分比和钙化面积的平均强度。扫描主动脉后，立即汇集两到三个主动脉以产生足够的蛋白质浓度。

在 1.5 毫升消化溶液中在 37 摄氏度下孵育两到三个混合主动脉两小时。收集溶液并以1， 000g离心15分钟以除去细胞碎片。接下来，除去微泡，再次将上清液以33， 000g离心30分钟。

收集并评估上清液的钙化潜力。通过离心从条件收集的培养基中除去细胞碎片后，将收集的上清液以33， 000g旋转30分钟。收集上清液并将其转移到新管中。

然后将1%的300毫摩尔磷酸二氢钠加入细胞外囊泡样品中，并通过移液混合溶液。将200微升混合物溶液转移到96孔板中，并将96孔板在酶标仪中以37摄氏度孵育。将酶标仪设置为每分钟记录340纳米波长的吸光度。

将300微升胶原蛋白溶液移液到八孔室玻璃的每个孔中，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育72小时。孵育后，向孔中加入300微升DMEM作为对照。将先前收集的300微升细胞外囊泡培养基样品加入剩余的孔中，并孵育六天，如前所述。

在第10天，将2.5微升OsteoSense和DMEM混合物移液到每个孔中，并孵育24小时。在孵育结束时，使用倒置显微镜通过盖玻片室的底部或从顶部使用长工作距离物镜对带有OsteoSense荧光滤光片的水凝胶进行成像。使用 ImageJ 中提供的颗粒分析选项评估钙化次数、钙化大小和收集的图像。

然后导航到图像，选择调整，然后单击阈值以二值化图像，以便只有 OsteoSense 信号显示为白色。然后使用"分析"并单击"分析颗粒"命令以获取图像中每个钙化的信息。使用相同的阈值参数以确保分析的每个图像的一致性。

解剖主动脉的近红外光学扫描仪成像显示，与对照小鼠的两个主动脉相比，患有慢性肾脏疾病的小鼠的整个主动脉具有更高的OsteoSense信号。从在促钙化培养基中培养的血管平滑肌细胞获得的条件培养基在340纳米处显示出比对照培养基更高的吸光度。与对照样品相比，促钙化样品的吸光度增加快1.5倍。

来自在促钙化条件下培养的细胞的条件培养基含有矿物质沉积物。在显微解剖主动脉时，仔细切割主动脉周围的脂肪很重要。您希望分析尽可能多的主动脉，但这可能非常乏味。

一旦分离出EV，就可以完成额外的测试，例如碱性磷酸酶活性测定或免疫体。这些测试将进一步显示电动汽车中存在的机制和蛋白质。