真菌β-葡聚醣是免疫系統的重要調節劑。提高纯度和分离方案对于断言其作为癌症治疗辅助佐剂的潜在作用至关重要。使用分子生物学和蛋白质组学实验室中常见的各种设备实现了四种不同β-葡聚糖的高度。
该协议的重点是测试β-葡聚糖对小胶质细胞的影响，小胶质细胞是大脑最丰富的常驻免疫细胞。调节胶质母细胞瘤中的小胶质细胞表型可以产生重要的见解。开始提取可溶性蘑菇多糖或SMP，用蒸馏水冲洗杏仁，刺头菇和灵芝的新鲜子实体五次。
然后将洗涤后的子实体在传统的空气干燥炉中在50摄氏度下完全干燥约24小时，然后在刀片磨机中研磨，从每个蘑菇中获得约200克粉末。接下来，将 100 克所有四种蘑菇粉或 MP 悬浮在 1， 000 毫升蒸馏水中，并在 121 摄氏度下高压灭菌 15 分钟。在室温下孵育30分钟后，将所得悬浮液在6， 000G下在4摄氏度下离心10分钟。
然后将含有不溶性蘑菇多糖或IMPs的沉淀物在50摄氏度下在空气干燥炉中干燥24小时。弃去沉淀物并将上清液在旋转蒸发器中浓缩10次。接下来，用乙醇在 4 摄氏度下沉淀含有 SMP 的浓缩物过夜。
将乙醇悬浮液在6， 000G下在4摄氏度下离心15分钟后，用移液管弃去上清液，用80%乙醇洗涤沉淀三次，然后溶解并蒸馏水。将pH调节至6.5至7，温度调节至37摄氏度，并通过分别用两个单位和四个单位的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理悬浮液来溶解α-葡聚糖。接下来，将pH调节至8.0，温度调节至50摄氏度，并通过用相当于每克蛋白质2.5单位的碱化酶处理悬浮液来溶解蛋白质。
水解后，离心水解产物并在旋转蒸发器中清洁上清液浓缩物五次。通过加入80%乙醇再次沉淀上清液浓缩物。为了去除低分子量分子，将沉淀物溶解在蒸馏水中，并使用12， 000道尔顿截止纤维素管膜将其在蒸馏水中透析24小时。
回收水溶性部分并将其冷冻干燥以产生可溶性β-葡聚糖或S β-G。分别评估总葡聚糖和α-葡聚糖。测量所得的β-葡聚糖值作为总葡聚糖和α-葡聚糖值之间的差异。
要使用紫外可见分光光度计获得 S β-G 紫外光谱，请在蒸馏水中制备每毫升 1.0 毫克的每种 S β-G。将样品转移到石英比色皿中，并在室温下扫描200至400纳米区域。使用配备紫外可见检测器和Superdex TM 200 10/300 GL凝胶过滤柱的高效液相色谱或HPLC系统，通过尺寸排阻色谱或SEC估计S β-Gs的均匀性和聚合物的分子量。
在傅里叶变换红外或 FTIR 光谱仪上记录每厘米 4， 000 至 500 范围内的样品红外光谱。通过用每毫升浓度为 0.2 毫克的四种不同的 β-葡聚糖涂覆 BV2 小胶质细胞 72 小时来激活小胶质细胞，这些β-葡聚糖是从 P.ostreatus、P.djamor、G.lucidum 和 H.erinaceus 中分离出来的。72小时后，用移液管收集上清液并将剩余体积通过0.20微米注射器过滤器。
然后将上清液在零下80摄氏度下冷冻至少24小时。要用预活化的小胶质细胞条件培养基处理GL 261，将250微升β-葡聚糖处理的小胶质细胞培养基加入80%汇合的GL 261细胞中72小时。72小时后丢弃培养基。
不同β-Gs的紫外光谱在260和280纳米处未出现紫外吸收峰，表明β-Gs缺乏核酸和蛋白质。HPLC色谱图均一性良好，主峰和单峰分别为10.9 min、灵芝10.5 min、11.3 min、8.20 min，表明馏分与均聚物一致。FTIR光谱测量了对应于共价多糖键的分子振动。
它表明SS β-Gs由与最小蛋白质结合的碳水化合物组成。HPTLC和GC-MS分析了S β-Gs的单糖谱，揭示了大量D-葡萄糖，少量D-半乳糖和D-甘露糖，以及微量的D-木糖，D-鼠李糖，D-岩藻糖和L-阿拉伯糖。使用ImageJ软件中的内部脚本，量化了每个荧光通道的正像素数。
该脚本使用对照样品作为每个荧光基团强度的阈值，并提供像素数。它指示了不同实验条件下每个标记物的表达。有趣的是，GL 261在暴露于不同的小胶质细胞条件培养基时在肿瘤增殖方面没有显着差异。
然而，P.djamor和H.erinaceus分别显示出裂解的半胱天冬酶-3增加约6倍和9倍的强烈诱导。确保β-葡聚醣的高品位纯度对于该方案至关重要。该方案使用先进的设备，如分光光度计，HPLC。
或FITR。使用这些工具增强了我们研究结果的稳健性。我们可以自信地分析β-葡聚醣对小胶质细胞的影响，并获得更可靠的结果。
由于时间和世界的限制，我们将我们的方案限制在研究小胶质细胞上的β-葡聚糖。然而，来自免疫系统的其他细胞，如巨噬细胞或T细胞，可以很容易地在这个协议中。这些协议首次结合了两个不同的知识领域。
首先，使用生物技术程序纯化特定产品，其次，使用细胞培养技术测试其免疫调节特性。
