使用加热块确定浮游动物的热限值

随着全球气温持续上升，量化热极限以及与驯化和个体发生的关系对于确定物种对未来变暖的脆弱性至关重要。对于具有复杂生活史的海洋生物，确定热极限在逻辑上可能具有挑战性。该协议引入了一种占地面积小，易于构建的方法，以估计小型浮游生物的临界温度。

虽然该方法是为小于一毫米的小型浮游生物开发的，但它可以用于适合约50毫升体积的闪烁瓶的大型海洋生物。首先将带状加热器连接到变阻器。在 6 x 10 尺寸的网格中钻 60 个孔，以准备尺寸为 20.3 x 15.2 x 5 厘米的铝块，并确保孔在两个方向上从中心到中心间隔 2 厘米。

在第一列和第二列以及第九列和第十列之间钻两个额外的孔，与温度控制器探头的尺寸相匹配。为了将元件固定到位并对完成的加热块进行绝缘，请用透明丙烯酸板构建一个外壳，确保在加热元件的背面应用两层。在最终装配中，涂抹导热膏以最大限度地提高从加热元件到块以及从块到冷却元件的热传导。

用Tygon管连接水浴，并将恒温器探头插入铝块侧面的孔中。在所有铣削的孔中，放置1.5毫升的微量离心管，装满自来水。打开温度控制器，将探头一的停止加热温度设置为35至37摄氏度，探头二设置为21.5至22.5摄氏度。

旋转变阻器以打开加热元件并将其设置为中等。打开水浴并将冷却器温度设置为 15 摄氏度。使用带有K型电极的热电偶，之后每10分钟检查一次每个微量离心管内的温度。

根据需要通过更改温度控制器和水浴的设置来调整端点的值。打开循环水浴和加热器，分别设置为15摄氏度和37摄氏度，以产生从19.5摄氏度到37摄氏度的温度梯度。一旦将微量离心管放置在铣削孔中并达到加热块的温度，请使用带有K型电极的热电偶检查每个微量离心管内的温度。

并记下这些温度。用海水填充1.5毫升微量离心管，通过0.45微米网过滤。通过反向过滤浓缩研究生物体的培养物，使生物体保持在烧杯底部。

用过滤的海水冲洗浓缩的培养物，并再次重复反向过滤以浓缩样品。在解剖显微镜下计数小型浮游生物，并使用玻璃巴斯德移液管将已知数量的生物转移到半填充的微量离心管中。现在加入过滤的海水，直到这些管中的最终体积达到一毫升。

现在将这些管成对放入加热块中，从冷端开始，让生物体逐渐升温到所需的实验温度。等待 10 分钟，然后将成对的微量离心管移动到温度较高的相邻钻孔中。在冷端的每一排中放置额外的微量离心管，并继续成对将它们移向较温暖的一端。

填充整个块后，在指定温度下孵育两个小时。在孵育期结束时，测量每个试管中的温度并记下。然后将所有试管转移到预先标记的支架中，并在预定温度下孵育一小时以使其恢复。

为了计数活生物体部分，使用玻璃移液管将单个微量离心管的内容物转移到35毫米培养皿中。在解剖显微镜下，数活生物体和死生物体并记下数字。观察到的生物数量应与最初采集的生物体相匹配。

如果没有，请检查微量离心管和培养皿的侧面，生成CSV格式的数据表，其中标题对感兴趣的变量，管的温度（以摄氏度为单位），活着的个体数和死亡的个体数。要使用逻辑回归拟合数据，请使用具有二项分布的广义线性模型。若要运行模型，请键入 source，并使用 R 文件 modelloop.r。

计算 50% 个体存活的预测变量值，以确定中位数热上限。使用该协议，在受精后两天，四天和六天测量幼虫沙美元的存活率，该存活率在19至37摄氏度的温度范围内。随着幼虫砂美元的发展，热上限从受精后两天的28.6摄氏度增加到受精后四天的28.8摄氏度，以及受精后六天的约29摄氏度。

孵化和恢复时间因物种而异。进行初步测试以确保所选时间产生可靠的活与死估计非常重要。