使用双光子全息显微镜评估和操纵神经活动

该协议提供有关神经活动的准确时空信息。该技术的主要优点是能够以高空间时间分辨率操纵和评估神经活动。它可能有助于说明导致神经活动异常的神经精神疾病的病原体。

这种方法可以应用于神经元的研究以及其他器官的健康。演示该程序的将是来自我们实验室的博士研究生郭忠天。头板植入后一天，在手术前一小时腹膜内注射1.32毫克/千克地塞米松磷酸钠，以避免脑水肿。

在立体镜下，使用牙钻进行直径约两毫米的圆形开颅手术。为减少脑损伤，请小心操作牙钻，不断轻微移动并轻轻向下按压。使用抽吸系统多次取出骨头碎片。

去除骨头碎片后，使用人工脊髓液或ACSF溶液去除并清洗大脑表面残留的任何碎片。重复此清洁程序几次以抑制炎症反应。使用压力注射系统，设置适当的压力，通过尖端直径为10至20微米的玻璃毛细管注入500纳升AAV溶液10分钟。

如果玻璃毛细管中的AAV溶液水平逐渐降低，则AAV溶液正在被施用于大脑。将玻璃毛细管再放置 10 分钟以防止回流。重复三次，将总共1.5微升AAV溶液注入大脑。

使用微量移液器将2%低熔点琼脂糖涂在S1的脑表面，然后用两个盖玻片在开颅手术上放置一个玻璃窗。将盖玻片压在琼脂糖上，当它仍然是液体时。这可以防止琼脂糖中形成气泡。

用牙科粘合剂树脂水泥密封颅窗的边缘。要校准全息刺激系统，请将红色荧光载玻片的表面放在样品平面上，并将显微镜设置为具有弱激发光的实时成像模式。运行校准 GUI。

mfile，选中参数窗格并单击保存按钮。单击第一步窗格中的 Z 扫描按钮，如果它将在每个平面相距两微米的 21 个不同轴向平面中自动生成三个随机点。移动滑动条并检查实时图像。

找到斑点最小和最亮的完美平面，然后单击"保存"按钮。这将自动生成数字全息图的偏移球面波前。单击步骤 2 窗格中的"开始"按钮，然后单击左侧方块上的六个点。

检查实时图像。如果有六个可区分的荧光点，则在编辑框中键入它们的 x 和 Y 轴，然后单击"保存"按钮。这将自动生成一个精细的变换系数，以协调全息刺激和成像系统之间的校准。

然后，点击 Scan 扫描 步骤三窗格中的按钮。它将生成441个数字全息图，以21×21步在整个视野中执行单点扫描。在列表框中更改模式时检查图像。

调整激光功率以获得成像设备动态范围内的光斑图像。将成像设备置于录制模式，然后单击播放按钮。播放完成后，单击第四步窗格中的生成权重图，然后选择堆叠图像。

然后关闭校准 GUI 窗口。它将自动生成一个权重图，以补偿每个点的不平衡强度。将带有顶板的AAV注射鼠标放在显微镜下，并使用全息显微镜和锁定钛蓝宝石激光进行双光子成像，该激光调谐至920纳米，具有25倍物镜。

在实时成像模式下打开商用成像软件。调整图像检测器的电压和成像激光器的功率，以优化表达GCaMP8f的神经元的亮度。捕获表达这种蛋白质的神经元的图像。

若要使用全息照明照亮特定神经元，请运行 SLM 控件。m 脚本文件。单击参考图像并选择获取的图像。

然后，单击"点"按钮以选择图像中神经元上的特定像素，然后按键盘上的"输入"按钮将其完成。要使用图像传感器以高时间分辨率检测神经活动，请设置曝光时间、成像区域和合并，然后执行图像采集。将鼠标放在显微镜下并进行双光子成像后，打开商业成像软件。

在实时成像模式下，调整图像检测器的电压和成像激光器的功率，以优化表达GCaMP-6m-p2A-ChRmine的神经元的亮度。捕获表达这些蛋白质的神经元的图像，然后按照前面显示的过程照亮特定的神经元。为了研究第二层和第三层神经元内的功能连接，使用空间光调制器生成光遗传学刺激的全息模式，并将其与双光子钙成像相结合。

将成像激光的强度设置为 920 纳米，在距离皮质表面 100 到 150 毫瓦的深度处，将视场设置为 256 微米 x 256 微米。将像素停留时间设置为 1.5 微秒（2 赫兹）或 100 纳秒（30 赫兹）。使用两赫兹和30赫兹作为成像帧速率，以查看单个全息刺激是否在神经元中引起钙反应。

将刺激单个神经元的全息刺激激光的强度设置为 10 毫瓦，足以诱导神经活动。同时，在 920 纳米处对钙铁响应进行成像，在 1040 纳米和 8 秒间隔处进行 10 次全息刺激，持续时间为 50 毫秒，基线周期为 10 秒。之后，将鼠标放回其主笼。

此处显示了在全息刺激和图像传感器的100赫兹成像中表达GCaMP8f的神经元的代表性图像和迹线。该图显示了每个激光功率下对全息刺激的神经反应。这里介绍了以 2 赫兹和 30 赫兹成像帧速率对 10 个不同神经元进行全息刺激期间代表性的钙 2+ 迹线。

相同的颜色表示相同的神经元。这里描述了评估神经元之间功能连接的示意图。当橙色神经元受到刺激时，红色神经元同时做出反应，表明这些神经元之间存在功能连接。

这里显示了野生型表达GCaMP6m的初级体感皮层神经元的典型图像。这些图形图像表示全息刺激期间以2赫兹和30赫兹成像帧速率的典型钙2+迹线。在两赫兹和30赫兹成像速度下都可以检测到对全息刺激的神经反应。

这些步骤对于减少大脑运动很重要，其次，获得稳定的结果。我们相信，这种显微镜可以诱导具有特定模式的神经元写入行为。通过这种技术，我们现在能够评估和操纵单个神经元的活动，并详细表征神经精神病学。