微流体辅助轴突线粒体选择性去极化

线粒体对神经元健康至关重要。在许多神经退行性疾病中，轴突线粒体是第一个遭受痛苦的疾病，但尚不清楚是什么让轴突线粒体如此特别。本协议中使用的腔室中的流体压力梯度允许对线粒体轴突进行选择性处理。

这使得细胞体过程不受干扰，并使我们能够专注于轴突生物学。我们在这里展示了线粒体用膜电位敏感染料的去极化，但这种方法可以应用于许多不同的神经元细胞类型和荧光读数。首先，将编码的六个孔板放入无菌罩中，并用无菌双蒸水洗涤两次。

让板在倾斜位置干燥三到五分钟。通过真空抽吸或移液去除多余的水分。然后将微流体室浸泡在80%乙醇中。

再次，在倾斜位置干燥微流体室三到五分钟，然后用移液器吸头除去多余的乙醇。完全干燥后，将微流体室放在孔和板的中心。轻轻敲击微流体室的边界和中间的微槽部分，以正确连接到玻璃板上。

首先，在1.5毫升反应管中收集所需数量的解离海马神经元。在室温下以1000倍G离心管四分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于八微升B-27神经基础培养基中。

然后将细胞溶液分配到微流体室的通道入口中。点击板的背面以协助流过通道。使用移液器在通道出口处吸出任何剩余的细胞悬液。

将微流体室与细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育15至20分钟。接下来，用50微升B-27神经基础培养基填充顶部轴突孔，并点击板的背面以辅助流动。用 150 微升 B-27 神经基础培养基填充体侧的每个孔，在顶部形成一个张力气泡。

还要用100微升的B-27神经基础培养基填充轴突侧的两个孔。体外培养七到八天后，确保轴突已通过微凹槽生长，并延伸到轴突隔室。通过去除 B-27 神经基础培养基并加入 100 微升预热的成像培养基到轴突和体细胞通道的顶部孔中来清洗装置。

让培养基流向较低的孔。从下孔中取出培养基，从顶部孔中取出任何剩余的培养基，然后用新鲜培养基重复，在洗涤结束时使孔空。然后将100微升的5纳摩尔TMRE稀释液加入体细胞和轴突顶孔中。

让培养基流过两个隔室，直到所有孔中的体积相等。用含有TMRE的培养基填充。在体细胞隔室中选择一个感兴趣的区域，并跟随它穿过微凹槽进入轴突隔室。

确保在体细胞和轴突隔室中成像的微凹槽彼此匹配。更改文件名后，使用561纳米激发和625纳米发射波长获取红色荧光图像。通过检查体细胞侧是否存在张力气泡来确保体细胞和轴突腔之间的体积差异。

然后从轴突侧的两个孔中取出成像介质，通道内的培养基除外。为了诱导线粒体去极化，将160微升在成像培养基中稀释的20微摩尔抗霉素A添加到顶部轴突孔中。让它流过通道，直到两个轴突孔中的体积相等。

重复成像，通过识别微凹槽，确保成像的位置与基线采集期间相同。使用该协议，原代海马神经元在微流体装置中生长，然后用膜敏感染料TMRE进行线粒体染色。在微槽的两侧观察到线粒体的均匀染色，但在中间没有。

在轴突侧加入抗霉素A后，体细胞线粒体保留TMRE信号，而轴突线粒体的荧光丢失 在组装设备之前，请确保孔中或设备上没有水分。否则，腔室将不会密封。使用这种方法，我们可以研究轴突线粒体功能丧失和局部功能的影响，以及它对逆行信号传导和全局细胞存活的影响。

长期以来，人们一直认为线粒体生物发生只发生在细胞体内。这种方法使我们能够揭示轴突线粒体损伤需要对短蛋白PINK1进行局部翻译。