用于微孔退火颗粒支架的单分散微凝胶构建块的高通量制造提供了对支架孔隙率的增强控制。这可能会影响孔径和随后的组织整合结果。该协议使用高通量微流控方法来产生大量单分散微凝胶，这是其他方法（例如流动聚焦微流体，批量乳液和电喷雾）无法实现的。
生成的微凝胶可以形成微孔退火颗粒支架，由于细胞规模的孔隙率允许快速组织和生长，因此有利于再生医学应用。首先为每个PDMS微流体装置准备一个载玻片。使用胶带、过滤空气或异丙醇洗涤液去除载玻片上的任何灰尘。
将PDMS设备设计中的载玻片放在96孔板盖上，并将其放置在等离子清洁器中。关闭门和气流阀，打开真空泵。让它运行至少 30 秒，然后将其关闭。
将氧气罐气管连接到气流阀。让等离子室充满氧气 30 秒，然后关闭氧气并关闭气流阀。打开真空泵并将射频电平设置为高。
等到腔室变成紫粉红色，等待 30 秒。当计时器响起时，关闭等离子和真空，然后慢慢打开气流阀以释放真空。从等离子清洁器中取出托盘。
轻轻地将PDMS设备翻转到载玻片上以粘合它们。发生粘合时，观察PDMS透明度的细微差异。为获得最佳效果，请将粘合的设备存放在 60 摄氏度下，直到使用前。
通过稀释PFOCTS和Novec油来准备表面处理，并在三到四个设备上使用一毫升。将体积转移到一毫升注射器中并连接25号针头。每个设备切割 10 到 12 厘米的 Tygon 管。
切一根长约一英寸的PEEK管。将几毫米的PEEK管插入Tygon管的末端，以防止针刺穿Tygon管入口。将设备从加热室中取出，并将Tygon管的非PEEK端插入水性入口孔中。
将表面处理注射器的针头插入PEEK管中并盖上油室出口孔。缓慢注射治疗，并确保它充满设备没有气泡。等待水室首先充满，然后是较小的通道，然后是油室。
从设备上拆下 Tygon 管。设备装满后，在室温下静置 10 分钟。仅用油填充五毫升注射器，并连接25号针头。
通过入口和出口将表面处理从设备中吸出。将泰贡管插入水性入口。将带油的注射器插入PEEK管中，并用油冲洗每个设备。
从设备中吸出油。重复换油两次并拆下 Tygon 管。将Tygon管的非PEEK端插入微流体装置的入口。
将末端没有PEEK管的剩余Tygon管插入微流体装置出口。在五毫升塑料注射器中加入至少三毫升油，并将其连接到 25 号针头上。小心地将针头插入其中一个 Tygon 入口上的 PEEK 管中。
用油轻轻冲洗管道和设备。将出口处的油收集在锥形管中。在另一个 Tygon 入口上重复油冲洗。
将注射泵设置为所需的流速。通过 25 号针头将含有表面活性剂的注射器连接到进油口，并轻轻分配足够的油以灌注微流体装置的管道和油通道。一旦设备和进油口设置好，将0.5毫升油添加到新的5毫升注射器中，该注射器将包含凝胶前体。
使用少量油帮助冲洗通过微流体装置的前体溶液。在锥形管中，混合1.5毫升PEG骨架溶液和1.5毫升交联剂溶液。涡旋30秒，快速将组合的凝胶前体溶液转移到5毫升注射器中。
通过25号针头将注射器与凝胶前驱体溶液连接到水性入口。轻轻分配足够的溶液以灌注管道和水通道。将注射器夹在注射泵上并按运行。
从通道中寻找大小均匀的颗粒。将微凝胶从出口收集在锥形管中。凝胶化完成后，使用移液器小心地从管底部去除油相。
将其放入适当的氟化废物容器中。向微凝胶收集管中加入更多油。轻轻倒置收集管进行混合。
让收集管沉降五分钟，让相分离。寻找底部的油相和顶部的水性微凝胶相。重复油洗至少两次。
如前所述，在凝胶中加入更多油，然后将PBS添加到凝胶中。倒置以混合几次。要分离层，请将管以2， 000 RCF离心约30秒。
寻找管底部的油相，中间的凝胶和顶部的PBS。用移液管去除油相并将其丢弃在废物容器中。重复油和PBS洗涤两次。
寻找凝胶在最后洗涤时从不透明过渡到透明。去除所有油。不要从锥形管中取出PBS。
在化学通风橱中，使用玻璃移液管将己烷以与PBS相同的体积添加到管中。涡旋锥形管30秒或直到充分混合。以 4， 696 RCF 离心五分钟。
分离后，在顶层寻找己烷，在中间寻找PBS，在底部寻找凝胶。去除己烷层并将其丢弃在有机废物容器中。吸出 PBS。
在PBS中重复己烷洗涤至少两次或直到凝胶看起来几乎半透明。再次用PBS洗涤凝胶以去除任何残留的己烷残留物。以 4， 696 RCF 离心五分钟，然后吸出 PBS 层。
20千道尔顿PEG马来酰亚胺中约67-75%用甲基丙烯酰胺官能团改性，以确保高退火效率。通过分析1H NMR波谱峰确定修饰百分比。凝胶化的开始提供了对微流体微凝胶生成的持续时间的洞察。
建议选择可在30分钟至2小时之间引发凝胶化的凝胶前体pH值。纯化和溶胀后，微凝胶具有均匀的大小和1.00至1.02之间的多分散指数，定义为单分散群体。退火后，微凝胶形成用双光子显微镜观察的多孔支架。
将PDMS器件正确粘合到载玻片上并正确对器件进行表面处理对于获得最佳微流体器件性能至关重要。该技术允许快速生产均匀的微凝胶构建块以形成映射支架，可用于各种体内再生应用，包括伤口愈合。
