使用真空稳定成像系统的实验性急性肺损伤中肺微循环的活体内宽视场荧光显微镜

该协议详细描述了手术制备和使用真空稳定系统对体内肺白细胞粘附和毛细血管灌注进行成像。这种技术的主要优点是，它允许对完整的镜像肺进行稳定的高分辨率活体内成像，同时尽量减少物理创伤。首先，通过在外圈顶部施用一层薄薄的真空润滑脂来准备成像窗口，同时避免污染真空通道。

将干净的8毫米玻璃盖玻片放在窗户上，然后轻轻按下以形成密封。将成像窗口连接到配有数字压力表的真空泵，该真空泵能够提供50至60毫米的水银恒定抽吸。将一段长度的光纤电缆穿过20号气管插管，并将尖端浸入盐酸利多卡因中。

麻醉后，插入改良的耳镜，使上门牙适合窥器的间隙。调整范围和舌头位置，直到会厌和声带清晰可见。将光纤电缆穿过窥器中的间隙，用小的圆周运动将电缆穿过声带之间，然后用光纤电缆作为引导，轻轻地将插管滑入气管中，使鼠标插管。

用1.5%异氟醚开始通气后，通过测试踏板反射来确认麻醉深度。用医用胶带将套管固定在鼻子上。使用标签胶带将右前爪固定在九点钟位置的加热垫上，并将左后爪向尾部伸出，固定在六点钟位置。

使用布带，将左前爪轻轻拉伸到12点钟位置，并将胶带的另一端固定到活体内显微镜平台的顶部，然后应用直肠温度探头和爪子脉搏血氧仪在整个实验过程中监测生命体征。为了准备手术，用70%酒精擦拭对胸部和腹部进行消毒，并涂上一层轻薄的矿物油来蘸湿小鼠左侧的头发。在肋骨笼底部附近做一个小切口，露出下面的肌肉层，然后延伸初始切口，用钝性解剖暴露肋骨。

使用止血钳，抓住解剖的上皮和脂肪组织，并清除手术区域。为了荧光标记白细胞和血流，通过尾静脉每公斤推注罗丹明6G和FITC白蛋白2.5毫升。使用齿形镊子，在末端吸气时立即抓住低于肺底位置的肋骨。

稍微缩回镊子以将肋骨从肺部拉开，然后切开肋骨以诱发气胸。在两个方向上横向扩展切口，注意不要接触肺部。用钝镊子抓住下一个最高的肋骨，并稍微缩回，让肺从胸壁上脱落。

如果肺没有脱离，将胸壁轻轻按压在肺上，使肺粘附在下面的胸膜上，从而更容易脱落。继续原来的切口，最终直到胸骨，颅骨直到肺的顶端暴露出来。使用涂抹棉花和纱布来减轻出现的任何出血。

抬起肋骨笼，露出胸腔背侧的肋间血管，注意不要损伤肺，烧灼脊柱附近最下肋间血管，然后切开相邻的肋骨。颅骨移动，最终使用重复的烧灼和切割模式来切除大约一乘二厘米的胸腔部分。为了准备成像，将活体显微镜平台转移到显微镜载物台，并将成像窗口直接放置在暴露的肺部上方。

使用微机械手小心地降低成像窗口，直到它粘附并稳定肺表面。要可视化肺部微循环，请使用装有20倍物镜和标准FITC和罗丹明滤光片组的宽视场荧光显微镜。使用黑白CCD相机以最佳对比度录制视频。

使用FITC过滤器组，根据血流的收敛模式识别肺部场所，并在聚焦场地的情况下录制30秒的视频，然后使用罗丹明过滤器集在同一视野中重复录制以可视化白细胞。要定位肺动脉，请使用FITC过滤器组来识别具有不同血流模式的血管并录制30秒的视频。使用罗丹明过滤器组在同一视野中重复记录以显示白细胞。

要定位感兴趣的毛细血管区域，请使用FITC过滤器集识别未与较大血管相交的肺泡和毛细血管区域，并录制30秒的视频。使用罗丹明过滤器组在同一视野中重复记录以显示白细胞。该视频描述了绿色箭头所示的肺部腔内血流的FITC成像。

罗丹明成像允许在同一场所可视化白细胞，其中两个粘附的白细胞由红色箭头指示。这些方法还用于可视化相同的现象以及感兴趣的肺动脉和毛细血管区域。为了证明微循环参数的定量，用鼻内LPS治疗小鼠以诱导肺部炎症。

这里显示了肺部腔室中的白细胞运输，其中轮廓区域代表幼稚和LPS治疗小鼠中分析的内皮区域。LPS处理的小鼠白细胞粘附和滚动增加。这里显示了肺动脉中的白细胞运输，其轮廓区域代表了在幼稚和LPS治疗的小鼠中分析的内皮区域。

LPS处理的小鼠白细胞粘附性较高。该图显示了幼稚和LPS治疗小鼠肺毛细血管内的白细胞粘附。LPS治疗小鼠的白细胞粘附率高于幼稚小鼠。

该图显示了幼稚和LPS治疗小鼠肺毛细血管的灌注。LPS治疗小鼠的功能毛细血管密度比幼稚小鼠低。该协议有很多具有挑战性的方面。

优化鼠标在平台上的位置是一个简单的步骤，可以使手术和成像步骤更具可重复性。该程序适用于广泛的研究参数和显微镜方法。因此，它应该促进健康和疾病状态下肺部微循环的进一步研究。