强大且高度可重复的皮质脑类器官生成，用于在体外模拟大脑神经元衰老

该协议解决了类器官生成中存在的一些关键问题，如健壮性和可靠性，我们能够将这些改进的类器官应用于神经元衰老的创新研究。异质性和可重复性是产生皮质脑类器官时的重要问题。为了克服这些，我们首先将hPSC分化为神经外胚层菌落，然后是神经上皮球状体，其产生可重复的组织结构。

这些皮质脑类器官在长时间的体外培养后开始表现出典型的衰老迹象，这使它们成为研究衰老相关神经元过程的有用平台。首先，将hPSC菌落从60%汇合的六孔板中的一个孔接成hESC合格的基底膜基质上，以达到20%至30%的密度，然后继续诱导2D神经外胚层菌落。在接下来的三天内，每天向每个孔中加入补充双重SMAD抑制剂的新鲜N2培养基。

为了从诱导的2D神经外胚层菌落中产生3D神经外胚层球体，从六孔板中取出两毫升N2培养基并用HBSS洗涤一次，以确保除去所有N2培养基。向每个含有菌落的菌落中加入一毫升分散酶。将板在37摄氏度下孵育20至25分钟，并定期检查菌落脱离。

在孵育结束时，为了停止分散酶的活性，向孔中加入一毫升N2培养基。使用宽口径P1000移液器吸头或用无菌剪刀切割的改良的P1000移液器吸头，将菌落转移到15毫升管中，并使菌落团块在重力作用下沉到管的底部。然后用标准的P1000移液器吸头，小心地除去上清液。

用一毫升新鲜N2培养基代替，重复洗涤三次，以确保完全去除分散酶。重悬细胞团块和N2培养基后，将细胞悬浮液转移到六孔板的一个孔中，并每毫升加入40 ng的bFGF。冷冻切片类器官后，通过将载玻片转移到带有盖子的载玻片染色容器中来除去多余的安装溶液，并在室温下用PBS洗涤切片的类器官组织三次10分钟。

然后将载玻片在37摄氏度下与新鲜制得的β-半乳糖苷酶染色溶液一起孵育过夜。用PBS洗涤染色组织三次，每次在室温下洗涤10分钟，以除去β-半乳糖苷酶溶液。现在用玻璃防淬灭剂安装洗过的组织，并让安装溶液在室温下固化30分钟，然后在显微镜下观察。

在神经外胚层分化之前，hPSC菌落表现出紧密扁平的单层形态，没有分化的细胞污染菌落。NANOG的表达也证实了hPSC菌落的多能性。hPSC菌落分化为神经外胚层菌落后，观察到较长的柱状形态，对NANOG呈阴性。

在对分散酶进行处理并暴露于N2中的FGF2后，这些球体中的神经干细胞增殖并形成大量神经玫瑰花环，通过在球体中心和外缘细胞中表达Z01来证明球体的顶基极性。一旦嵌入，球体迅速增殖并开始萌芽，这表明存在致密的组织节点及其在一到三周之间从主体向外扩张，这通过定量分析进一步证实，球体直径在三周内显着增加。免疫荧光染色证实了类器官中存在神经祖细胞和皮质层标志物，具有清晰的层，可以在不同的时间点观察到。

还研究了神经元衰老相关过程对大脑的影响。随着时间的推移，观察到衰老相关β-半乳糖苷酶的存在显着增加，并且在第13周，检测到p21的存在，这表明衰老。重要的是要确保所有多余的分散酶都被去除，并且轻轻地分离并重新播种完整的神经外胚层菌落以形成健康的球体。

这个平台是我们研究人类大脑衰老生物学的独特机会，它也允许对关键大脑发育进行研究，前提是使用生物反应器培养这种类器官。