冷冻电镜已成为蛋白质及其复合物结构测定的标准技术。该协议描述了如何从中档200 kV透射电显微镜获得高分辨率Cryo-EM数据集的最佳实践。冷冻电镜可以同时确定溶液中接近天然条件下的多种构象状态和功能状态的蛋白质结构，这对于其他结构技术来说是难以捉摸的。
获得的结构信息可用于阐明蛋白质功能的分子机制，以及基于结构的药物设计。例如，最近在淀粉样纤维结构方面的出版物揭示了重要配体的多个结合位点。然而，在该协议中，我们使用阿普铁蛋白和蛋白酶体的标准样品来证明获得高分辨率Cryo-EM数据的关键步骤。
在过去几年中，冷冻透射电镜的操作变得更加容易，特别是由于引入了先进的自动化功能。但是，对于第一次会议，我们建议您与更有经验的用户一起接受培训。从那里开始，技术的进步相对较快。
演示该程序的将是Adrian Koh，他是Thermo Fisher Scientific的高级应用科学家。在液氮条件下将自动格栅插入自动装载机盒中。将带有自动网格的盒插入液氮冷却的转移胶囊中。
进一步将胶囊插入显微镜，然后单击显微镜UI中的Dock按钮，将胶囊中的盒式磁带加载到显微镜的自动加载器中。单击"库存"按钮以检查已加载的盒中是否存在自动网格。然后单击"加载"和"卸载"按钮，将自动网格插入到列中以进行TEM成像。
选择 Atlas 选项卡，然后单击新建会话按钮以打开新会话。填写会话名称和数据存储位置等详细信息，然后单击"应用"按钮。通过选中相应网格编号旁边的复选框来选择感兴趣的网格。
单击"开始"按钮以启动所有选定网格的完全自动化的地图集集合。集合完成后，单击网格标签以查看获取的地图集。选择 EPU 选项卡，然后转到"新建会话"以在左侧面板中创建新会话。
选择"新建会话"选项以使用当前设置的光学预设。填写会话名称。选择会话的手动类型，以控制稍后在协议中为数据收集选择的各个孔和网格方块的选择。
选择更快的采集模式，使用无像差图像偏移进行数据采集。然后输入保存元数据的位置。单击"应用"按钮以创建新会话。
在左侧面板中选择方形选择任务以显示收集的网格图集。识别网格正方形，具有完整的支撑箔而不会损坏，薄玻璃体冰和箔孔，网格正方形中可忽略不计的结晶冰污染以及网格正方形和单个箔孔内的最小亮度梯度。选择用于数据收集的网格方块，无论是在完整的图集还是高质量的切片图像中。
右键单击感兴趣的网格方块，然后选择整个选择任务。单击"自动优心"按钮可自动移动到第一个选定的网格正方形。调整共心高度并获取网格正方形图像以查找箔孔。
单击"查找孔"按钮以查找图像中的箔孔。单击"移除孔"按钮以关闭网格条按钮以取消选择网格条附近的孔。调整冰过滤器亮度直方图中的限制，以清除所有冰太厚的孔和所有空孔。
右键单击网格正方形图像中的孔，然后选择"移动舞台到此处的位置"移动舞台。在左侧面板中选择模板定义任务。单击"采集"按钮获取整个图像。
将图像偏移后的延迟值设置为 0.5 秒，将分级后的延迟值设置为 5 秒。单击"查找并居中孔"按钮，将图像中的孔居中。选择"添加采集区域"按钮，然后单击图像以选择在中心孔中进行高放大倍率图像采集的位置。
选择"添加自动对焦区域"按钮，然后单击图像以选择支撑箔上的位置，该位置位于将执行图像自动对焦的中心孔旁边。单击绿色的"采集区域"，在软件窗口顶部的散焦列表中设置一系列散焦值。设置自动对焦特定设置后，选择选项"居中后"以在每个 AFIS 群集开始时自动对焦。
选择物镜选项，实现更快的自动对焦和更低的载物台漂移。单击孔选择任务中的"准备所有方块"按钮，可根据第一个格网方块中使用的设置自动设置数据收集和所有其他选定的格网方块。选择模板定义任务，获取新图像，通过右键单击将舞台移动到碳箔上的干净区域，然后选择菜单选项将舞台移动到此处。
选择"自动功能"选项卡。设置所需的散焦和迭代后，切换到自动对焦预设，然后单击开始按钮以运行自动对焦功能。选择"自动恢复"任务，切换到"传递环"预设，然后按"开始"按钮。
选择"自动昏迷"任务，然后按"开始"按钮 。将舞台移动到网格正方形断开的区域。通过拍摄单个自动对焦图像来确认区域的透明度。
打开夏尔巴 UI 并选择能量过滤器应用程序。单击"中心"按钮和"零损耗"选项，将零损耗能量滤波器狭缝居中。单击等色性选项中的"调谐"按钮。
单击几何和色度失真中的"调谐放大倍率和调谐失真"选项。转到 EPU 选项卡，选择"自动采集"任务，然后单击"开始运行"按钮以开始全自动数据收集。该图显示了Cryo-EM网格，该网格在网格表面上显示冰厚梯度。
从进一步调查中排除的网格是具有厚冰的坏网格和具有坏冰和污染的弯曲网格，而可接受的网格是具有良好冰梯度和具有良好薄冰和小冰梯度的典型网格。该图显示了重建的阿泊铁蛋白冷冻电镜图的最终3D渲染。高稳定性和对称性使其成为高分辨率冷冻电镜成像和图像处理的最佳基准样品。
贝叶斯抛光、CTF 细化和 Ewald 球体校正产生了 1.63 埃的分辨率图。该图显示了在单个氨基酸侧链水平上重建的阿扑铁蛋白Cryo-EM图谱的详细视图。氨基酸侧链的密度得到了很好的解决，原子模型可以在图谱中明确地构建。
这里的图像显示了从同一Cryo-EM网格收集的不同散焦值的两个不同的数据集，具有相似的网格正方形，其中狭缝完全打开，10电子伏特狭缝表明10电子伏特狭缝显着改善了图像对比度。该图显示了20S蛋白酶体Cryo-EM图谱的概述，其中分段的亚基用作标准Cryo-EM样品。其带有拟合原子模型的放大视图代表了具有D7对称性的蛋白酶体复合物的稳定催化核心。
该协议包含两个关键步骤。第一，寻找含有均匀颗粒的薄玻璃体冰的区域。第二，为数据采集设置并行照明。
通过蛋白质的高分辨率重建达到两到三埃的分辨率，您可以更好地了解疾病的分子机制并改善药物先导物。以前，如果你想研究生物现象的结构基础，结晶是必要的。今天有了冷冻电镜，这不再是必需的。
因此，通过冷冻电镜，我们使科学家能够在结构水平上研究更广泛的生物现象。
