这里描述的手动切入法是制备用于透射电子显微镜样品的具有成本效益的可靠方法。在本视频中，我们将演示如何设置手动柱塞，准备冷冻剂，以及执行EM网格的手动印迹和陷印。准备手动插孔环境。
此过程应在湿度大于95%的40摄氏度的冷藏室中进行，我们建议使用此处显示的材料以及在线协议中所述的手动转印和插入。准备低温杜瓦瓶和手动柱塞。要组装低温杜瓦瓶，首先将平台底座安装在蓝色聚苯乙烯泡沫塑料杜瓦瓶的底部，确保其平坦且水平。
然后将乙烷容器支架放在平台底座的顶部，并插入黄铜乙烷容器。最后，设置旋转网格存储平台。接下来，将坠落的杜瓦瓶定位到手动柱塞的底部。
将乙烷容器置于沉入臂下方，并将沉入式杜瓦瓶固定在底座上。要设置手动跳入高度，请首先将新胶带固定在插孔臂的底部。接下来，通过将胶带牢固地缠绕在插孔臂和镊子底座上来固定一对夹紧镊子。
轻轻敲击镊子，确保镊子牢固地固定。握住下陷臂，通过踩下脚踏板，将镊子慢慢放入黄铜乙烷容器中。调整沉入杜瓦瓶的位置，使镊子位于黄铜乙烷容器的中间。
镊子的尖端不应接触黄铜乙烷容器的尺寸或底部，以免损坏镊子和手动柱塞。设置位置后，重置手动插臂。准备冷冻剂。
应在通风良好的房间内进行冷冻剂制备，并应始终佩戴适当的个人防护装备。首先，劣质液氮直接进入杜瓦瓶，当液氮水平达到黄铜乙烷容器的顶部时停止。系统应足够冷，以便在液氮停止剧烈冒泡后继续进行。
这大约需要五分钟。乙烷是一种压缩气体，需要冷凝。要设置气流以获得最佳乙烷冷凝，请将乙烷气体管路的尖端插入250密耳的水烧杯中并观察气泡。
气流应产生稳定的气泡流，不会剧烈破坏水面。要开始冷凝乙烷，请将乙烷气体管路的尖端放在黄铜乙烷容器的底部。慢慢搅拌金属尖端，开始液化乙烷。
一旦乙烷开始冷却，它就会发出可听见的声音。将黄铜乙烷容器装满四分之三的液体乙烷。用液氮填充沉入式杜瓦瓶，确保它接触到黄铜乙烷容器，但不会溅入其中。
液氮的添加对于均匀的乙烷冷冻是必要的。将泡沫盖放在蓝色的杜瓦瓶上，让乙烷完全凝固。重新启动乙烷气流，并小心地将气体管路的尖端放入固体乙烷中。
将尖端垂直放入容器中并在底部分配乙烷非常重要。缓慢搅拌金属尖端以熔化乙烷，并将液态乙烷的水平提升到容器的顶部。盖上盖子约一分钟，让乙烷在黄铜容器的边缘周围凝固，直到看到两到三毫米的固体乙烷。
乙烷现在处于冷冻生物样品的理想温度。将坠落的杜瓦瓶小心地固定在手动柱塞的底座上。通过将胶带牢固地缠绕在插孔臂和镊子底座上来固定一对夹紧镊子。
握住下陷臂，通过踩下脚踏板，将镊子慢慢降低到液态乙烷中。调整沉入杜瓦瓶的位置，使镊子位于液态乙烷的中间，避免与固体乙烷环接触。准备插孔材料和附件。
通过将每个圆形滤纸切割成约一厘米宽的条带来准备印迹纸。避免触摸吸墨纸的中心，并丢弃较小的端部。重要的是要确保吸墨纸条干燥、干净且无污染物。
在跳入之前，将网格盒放入插入的杜瓦瓶中，放入适当的插槽中。确保网格覆盖我们自由旋转。通过骤降冷冻准备冷冻电镜标本。
由于网格和网格准备的多样性，请遵循推荐的使网格亲水的协议。为了正确处理网格，请使用干净、干燥的夹紧镊子拾取外圈处的亲水网格。滑动塑料夹以固定网格，然后轻轻敲击镊子以确保正确夹紧网格。
将三微升样品施加到夹紧镊子中固定的网格前面。通过将胶带缠绕在镊子底座上，将镊子牢固地固定在手动插臂上。样品现在已准备好进行吸墨和冷冻。
将干净的吸墨纸条的每一端夹在食指和拇指之间。将双手放在坠落的杜瓦瓶的边缘，以建立稳定的位置。印迹纸应距离网格表面约一厘米。
弯曲吸墨纸，直到中心接触到网格。重要的是，印迹纸应平行于网格表面，以便均匀接触并防止网格损坏。当移动液体前部停止扩散时，开始计数。
擦拭网格五秒钟。将手指分开，拉紧吸印纸，然后迅速将其从网格表面取出。同时，踩下脚踏板以释放手动插臂，将固定网格的镊子插入液体乙烷中。
将刚冻结的网格保持在液体乙烷中，小心地将镊子从手动插臂上取下。小心地解开镊子，使网格可拆卸。将网格移动到黄铜乙烷容器下方的液氮储罐中，从乙烷到液氮的快速运动。
将网格放置在网格框中。具有代表性的结果。从这个视频中，研究人员应该能够准备像这样的CryoEM网格，其中许多方块含有玻璃体冰的薄膜，用于高分辨率成像。
可以调整样品浓度和转印时间以优化颗粒密度。在这里，我们将演示使用印迹和暴跌法冷冻冷冻冷冻EM样品的完整工作流程。使用干净的夹紧镊子拾取新的网格并将网格固定到位。
将三微升样品涂在网格的亲水性一侧，并通过将胶带缠绕在镊子手柄上，将镊子固定在手动插臂上。将印迹纸平行于网格表面放置，然后轻轻地将印迹纸向网格弯曲以启动印迹。在所需的时间之后，以快速的动作将吸墨纸从网格表面移开，同时踩下脚踏板以释放下陷臂，将网格插入液体乙烷中。
小心地从镊子和手动插臂周围松开胶带。只需快速移动一下，即可将网格从乙烷容器快速转移到液氮储液槽中。将网格放入网格存储盒中，并将镊子包裹在Kim Wipe中晾干;重复。
