使用连续截面电子显微镜对肝细胞中组织间接触位点进行三维表征

该协议允许以简单而强大的方式对细胞器进行3D重建，同时可供目前没有专业体积电子显微镜的实验室使用。这种技术非常灵活，可提供出色的X / Y分辨率，同时能够在必要时重新成像样品。当需要非常高的Z分辨率时，它还与倾斜断层扫描兼容。

该技术允许在细胞间背景下询问细胞器形态。因此，它可以扩展到检查任何具有细胞器缺陷的病理状况。这种方法可以提供对细胞器相互作用和细胞运输事件的见解。

除肝细胞外，该方法还可以应用于其他组织，类器官模型和细胞培养系统。首次使用的用户可能会发现串行切片和拾取具有挑战性而不会丢失。建议在将此方案应用于珍贵样品之前，先精通常规的超薄切片。

首先使用剃须刀片仔细修剪树脂嵌入的组织，并将样品锁定在修剪适配器中。将试样方舟与卡盘和试样一起转移到切片机的试样臂上，并定位试样方舟，使方舟的行程范围从上到下。将金刚石刀放入刀架中并锁定，确保刀的切割角度设置得当。

将刀架牢固地锁定在载物台上。关闭载物台筒灯，打开载物台升光灯，小心地将刀移向试样，通过调整相关旋钮不断调整刀的横向角度，试样倾斜和试样旋转，直到块面与刀刃对齐。设置试样臂切割窗口的顶部和底部，并将试样留在刀刃正下方。

用干净的双蒸馏水填充刀舟，并确保水面与刀刃水平且略微凹陷。然后，开始切割截面。在样品通过刀刃后停止切割。

使用空槽网格来估计要在每个网格上收集的截面数。每只手都用睫毛，轻轻地将丝带分成较小的丝带，可以适合插槽网格的长度。在脑海中记下它们在样本中的相对位置。

使用玻璃涂抹杆，将一滴氯仿悬停在各部分上以使其变平。用第一个编号的镊子拿起第一个空槽网格，轻轻地将其浸入Triton X-100中，然后在蒸馏水中浸泡两次。用一张滤纸从镊子边缘去除多余的水分。

使用镊子，将大约2/3的formvar涂层槽网格轻轻降低到刀舟的水中。确保福尔摩一侧朝下，槽的右长边在水面上，与水边平行。轻轻地将水中的网格向色带飘动，以便在返回行程时，各部分向网格漂移。

继续在越来越小的波浪中执行此操作，直到丝带的右手边缘与插槽的右手边缘对齐。然后，在最后一个波浪中，轻轻地将网格向上拾取部分到插槽网格中。将几粒氢氧化钠颗粒放在培养皿盖下，以提供无二氧化碳的环境。

然后，小心地将40微升的雷诺酸铅滴在parafilm上，每个网格一滴。将每个网格倒置到柠檬酸铅滴上，并在培养皿盖下放置7至10分钟。当网格染色时，在parafilm上为每个网格放置五个约300微升的蒸馏水滴。

在柠檬酸铅孵育结束时，将每个网格转移到蒸馏水滴中洗涤一分钟，而不直接在网格上呼吸。再重复四次。使用带编号的交叉镊子拾取第一个网格。

触摸网格的边缘以过滤纸以吸走大部分水，并在镊子中干燥至少20分钟。对每个网格重复此操作。在低放大倍率下，观察序列部分的顺序、位置和位置。

导航到网格上系列的中间部分。浏览示例并确定感兴趣的区域。然后，以所需的放大倍率观察样品。

请考虑以略低的放大倍率收集序列，因为部分通常不完全对齐，并且以后可能需要裁剪图像。接下来，以较低的放大倍率拍摄参考图像。这将有助于了解感兴趣区域的上下文，它在相对于剖面边界的不同放大倍率下的粗略位置，以及样本中的地标性特征。

使用它们来标记其他部分中感兴趣的区域。对于屏幕参考，请使用可重复使用的胶灰、贴纸或贴在屏幕上的一张高架投影仪纸，在屏幕上放置临时标记。这将允许对整个数据集中图像中心的感兴趣区域的相同特征进行例行的重新想象。

打开图像堆栈，指定体素测量值，然后选择"分割"选项卡以开始分割。单击分割编辑器面板中的新建以定义材料列表中的新对象。右键单击以更改对象的颜色，然后双击以重命名对象。

对于手动分割，请选择材料列表下方的分割工具，然后选择默认的画笔工具以突出显示像素。这里显示了两个相对的肝细胞的电子显微镜图像。更高的放大倍率成像允许以纳米分辨率观察不同细胞器的形态学细节。

代表性图像显示了同一断层扫描的分割版本，内质网，线粒体的痕迹以及ER与不同空间的线粒体之间的膜间接触。代表性图像显示了覆盖有分割痕迹的倾斜正交切片及其在整个线粒体中的相对位置。这里显示了分段细胞器和内质网 - 线粒体在不同角度的接触的3D重建。

由于当需要非常高的Z分辨率时，该协议与倾斜层析成像兼容，因此有助于解析小或卷曲的结构。该技术非常适合于对不同细胞器之间空间关系的初步评估，因此，在膜稳态的膜接触进展领域特别有用。