iPSC来源心肌细胞中的高通量光学控制和记录钙信号，用于毒性测试和表型药物筛选

我们展示了无数用于iPSC来源心肌细胞中触发细胞活性的所有光学控制和观察的方法，用于高通量药物筛选和毒性测试。能够在时间和空间上对表型模式进行多参数量化，允许在数小时或数天内观察药物的效果。该方法可应用于不同类型的细胞，如神经细胞或β细胞，进行功能筛选和毒性测试。

演示该程序的将是我实验室的生物成像工程师Wan-Chi Su。在将iPSC心肌细胞从冷藏库中取出进行解冻之前准备多孔板。用100微升0.02%明胶溶液用每毫升50微克纤连蛋白涂覆96孔微板的每个孔，以彻底覆盖所有表面。

将iPSC心肌细胞从液氮储存罐转移到37摄氏度的水浴中。将小瓶带到二级生物安全柜中，轻轻地将内容物转移到含有9毫升室温培养基的新15毫升锥形管中。在室温下以200倍G离心细胞三分钟。

通过移液管弃去上清液，并用10微摩尔ROCK抑制剂Y27632轻轻地将细胞重悬于一毫升培养基中。根据制造商的说明，板细胞包被96个孔板，密度为每平方厘米100， 000至150， 000个细胞。24小时后，确保附着在板表面的细胞与其他细胞接触。

将细胞接种72小时后，将GECIs病毒试剂盒在冰上解冻。用维持培养基制备双倍强度的病毒试剂盒储备溶液。通过将培养基体积调节到每孔100微升来准备感染细胞。

向孔中加入100微升预混病毒溶液，并在37摄氏度下孵育8至16小时。孵育后，更换200微升预热培养基。使用成像系统在转导后 24 小时可视化 GECIs 表达。

在进行功能测定之前，将细胞保持在加湿的培养箱中。打开高内涵成像系统的所有设备。验证腔室温度是否达到 37 摄氏度，并补充 5% 的二氧化碳。

打开成像软件，然后选择 96 孔板的板设置。将未盖的96孔板放入腔室中，并将活细胞密封环加载到顶部。根据所需的空间分辨率选择20X、60X和20X水浸物镜。

在实验采集之前调整焦点以拍摄清晰的图像。每孔随机选择三到五个区域进行钙活性记录。为不同的指标选择合适的过滤器。

为使用的每个成像通道设置适当的发光二极管功率。将相机曝光时间设置为最长 40 毫秒或 25 赫兹，并将流采集的记录持续时间设置为 30 秒，以观察心肌细胞中表达的 MNG-GECO 和 K-GECO 探针报告的钙瞬变。如果在较高帧速率下信噪比小于 2，则增加 LED 功率。

对于光遗传学刺激，以一赫兹优化蓝光的功率和频率，然后开始采集。将E4031多非利特和维拉帕米重新悬浮在DMSO中，并用Tyrode缓冲液稀释。将化合物排列到相应的靶标孔中。

通过自动微流体系统将100微升双强度化合物添加到孔中，并在所需的孵育期后开始采集。通过使用软件自动检测脉冲功能，随时间推移的分辨率，将信号区域与背景隔离开来。使用钙峰分析软件分析跳动频率、峰值信号、钙瞬态持续时间 50%钙瞬态持续时间 90% 上升时间和衰减时间。

视频中演示了在有或没有药物治疗的情况下，iPSC衍生的心肌细胞表达的NMG-GECO中自发钙振荡的观察结果。使用MNG-GECO获得的动力学迹线显示，小分子离子通道抑制剂Verapamil，Dofetilide和E4031如预期的那样影响钙瞬变。为了评估E4031在标准化、有节奏的条件下的剂量反应，使用1赫兹和470纳米光脉冲对表达iPSC CMs和K-GECO进行光学控制，并使用红色K-GECO信号观察。

随着E4031浓度的增加，峰值振幅逐渐降低，钙瞬变衰减时间增加。E4031的剂量依赖性效应对于峰振幅的降低最为明显。病毒转导一个月后，仍然可见明显的钙瞬变，或者没有用于光学起搏的额外光。

该图描述了一种药物，该药物似乎在LVNC iPSC CM模式下增加搏动率，使收缩间隔规则化并增加瞬时钙振幅。搏动频率的变异性以及随后对钙瞬时持续时间的影响也随着iPSC CM在培养中的维持而变化。已经开发了几种GECI，包括ER LAR-GECO，MTG-Sepia和NIR-GECO，用于单独表达或在细胞模型中组合表达，以分别在内质网，肌质网，线粒体和细胞质质中产生实时钙活性测量。

GECIs可以在iPSC CM模型中组合，以研究不同的细胞内钙储存。表达K-GECO的心肌细胞随着时间的推移表现出一致的跳动行为。然而，Fluo-4负荷同时影响了该模型中的搏频和CTD，这表明Fluo-4本身可能会影响此类实验的结果。

我们提供了一种简单的方法来研究对照细胞和患者来源细胞的表型谱，而iPSC中间体可以揭示各种疾病的药物发现。