无需细胞分选即可从快速冷冻的异质组织样品中分离细胞类型特异性RNA

该协议旨在从复杂组织中的少量细胞中获得高质量的细胞类型特异性RNA，而无需细胞分选。它采用了最近可用的小鼠模型，允许研究人员使用GLP下拉分离核糖体结合的RNA。该方法也适用于从任何表达EGFP的细胞中分离核糖体结合的RNA。

首先，将两毫升冰冷的均质工作缓冲液添加到玻璃组织研磨机组中。快速将冷冻样品放入研磨机中，并使用松散的杵在冰上按 30 次冲程均质组织。将匀浆转移到两毫升圆底管中，在4摄氏度下以12， 000g离心10分钟。

然后将上清液转移到新的两毫升管中而不干扰沉淀，保留100微升作为输入。将上清液与抗GFP抗体在4摄氏度下孵育，末端旋转过夜。将匀浆和抗体混合物转移到含有洗涤蛋白g珠的新两毫升圆底管中，并在旋转器上以24RPM孵育4摄氏度两小时。

使用磁性架将磁珠与上清液分离。将上清液保存为负部分，其中包含EGFP阴性细胞中的RNA和EGFP阳性细胞中不与核糖体结合的RNA。向珠子中加入一毫升高盐洗涤缓冲液，并短暂涡旋管以洗涤珠子。

然后将试管放入磁性架中。取出洗涤缓冲液并重复洗涤步骤两次，以从EGFP阳性细胞中获得珠核糖体RNA复合物。将磁珠与 RNA 分离试剂盒中的 50 μL 提取缓冲液在热混合器中孵育 30 分钟，以释放磁珠中的 RNA。

用磁性架分离珠子，并将上清液转移到1.5毫升管中。将试管以3000g离心两分钟。然后将上清液移液到新的1.5毫升管中。

为了预调节RNA纯化柱，将250微升预处理缓冲液移液到纯化柱上，并在室温下孵育5分钟。然后将色谱柱以16， 000g离心一分钟。将等体积的70%乙醇移液到细胞提取物中，并通过移液充分混合。

将多达200微升的混合物移液到预处理的RNA纯化柱中。为减少样品损失，填充柱的容量不要超过其容量的80%。重复此步骤几次，直到所有RNA收集在每个级分的同一列中。

将色谱柱离心两分钟，将RNA结合到色谱柱中的膜上。然后继续离心30秒。丢弃流过并将100微升洗涤缓冲液一移入色谱柱中。

离心一分钟，然后丢弃流过。将75微升DNA溶液直接混合到纯化柱膜中。在室温下孵育15分钟。

然后，将40微升洗涤缓冲液移入色谱柱中，再离心30秒。丢弃流过。将100微升洗涤缓冲液两个移入色谱柱中，并以8， 000g离心一分钟。

丢弃流过。将PET 100微升洗涤缓冲液二放入柱中，并以16， 000g离心两分钟。丢弃流过，并以16， 000g重新离心同一色谱柱一分钟，以除去所有痕量的洗涤缓冲液。

将色谱柱转移到新的1.5毫升微量离心管中。将12微升游离RNase的水直接移液到纯化柱的膜上，确保移液器吸头不接触膜。在室温下孵育一分钟，并以1000g离心一分钟。

然后在16， 000 G下洗脱RNA。使用生物分析仪评估提取的RNA的质量和数量。将RNA储存在80度的冰箱中或送出进行进一步分析。

携带基因工程基因等位基因Gli1-CreERT2和NuTRAP的小鼠我们每天注射一次他莫昔芬，每隔一天注射三次。采集组织的免疫荧光分析显示，EGFP在睾丸的间质细胞中表达。EGFP也在Gli1-CreERT2，NuTRAP小鼠的肾上腺包膜细胞中发现。

在Sonic Hedgehog-CreERT2中，NuTRAP小鼠EGFP阳性细胞群位于胶囊下方的肾上腺外皮层，证实了EGFP预表达细胞的表达。提取细胞类型特异性RNA后，将提取的RNA送去进行微阵列分析。结果表明，与阴性部分的基因相比，约3000个基因在阳性部分富集，而阴性部分约有4， 000个基因富集。

在差异表达基因中，Leydig细胞相关基因Hsd11b1和Hsd3b6富集在阳性部分中。在阴性部分中，Sertoli细胞相关基因沙漠刺猬和Gstm6富集。在比较负部分和输入时，仅鉴定出几个差异表达的基因。

采用实时定量RT-PCR确认阳性和阴性组分中关键基因的表达。与微阵列测定中发现的类似，类固醇生成酶3-β羟基类固醇脱氢酶和胆固醇侧链裂解酶富集在阳性部分中。同时，Sertoli细胞标志物SRY盒转录因子9和生殖细胞标志物突触复合蛋白3在阴性部分富集。

尝试此方案时，重要的是制备新鲜的均质工作缓冲液，仅在使用前将DTT，环己酰亚胺重组核糖核酸酶和蛋白酶抑制剂混合物添加到匀浆储备溶液中。使用前准备新鲜的低盐和高盐洗涤缓冲液也很重要。