非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠整个视网膜血管参数的定量

在视网膜病变中，血管改变是临床医生发现的第一个体征。他们跟随疾病的进展，并根据这些变化选择治疗方法。为了研究病理学的不同阶段，已经开发了几种动物模型。

在这项工作中，我们将展示如何测量不同的血管改变。为此，我们将采用两种动物模型。其中之一是氧气诱导的视网膜病变小鼠模型，它再现了早产儿的视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变的某些方面。

在这里，我们将测量缺血区，新生血管区以及小动脉的扩张和曲折。在我们的实验室中，开发了一种代谢综合征小鼠模型，该模型诱导非增殖性视网膜病变。在这项工作中评估了血管密度和分支。

在小鼠被处死后，用剪刀去核。在室温下用新鲜制备的多聚甲醛固定去核的眼睛一小时。在解剖显微镜下，用剪刀沿着边缘切除角膜，并解剖整个视网膜。

丢弃眼睛的前段，然后将视网膜与RPE脉络膜分开。将视网膜置于200微升管中。然后在6小时内以4度阻断并渗透100微升含有5%牛血清白蛋白Triton的TBS中的视网膜，并在摇摇杯中轻轻搅拌。

然后倒置管子将视网膜放入杯中，并用移液管取出阻塞溶液。加入含有异凝素的100微升溶液。用铝箔包裹管子，以保护样品免受光照。

用凝集素溶液在四度下孵育视网膜过夜，并在摇摇杯中轻轻搅拌。用100微升TBS-Triton清洗视网膜20分钟，在摇摇杯中轻轻搅拌。重复此步骤三次。

将视网膜放入载玻片中，然后添加一滴PBS。在解剖显微镜下，从视网膜边缘向视神经进行四次等距离的切口。要展开视网膜的花瓣，请使用镊子或小块滤纸。

确保感光器侧朝下。用滤纸从载玻片上取下剩余的 PBS。然后添加安装中位数和盖玻片。

让它在室温下干燥一小时。将载玻片存放在四度，避光。在共聚焦显微镜下，将载玻片面朝下放在板中。

聚焦视网膜脉管系统的上神经丛，然后选择一个区域开始图像采集。在软件中设置一般激光参数。在 X、Y 和 Z 轴中设置坐标。

初始化扫描。扫描过程完成后，打开图像并使用首选扩展名保存。在 ImageJ FIJI 软件中，转到菜单栏，然后单击文件、打开。

选择要处理的图像。在"生物格式导入选项"窗口中，选择"显示 OME-XML 元数据"，然后单击 OK.In"OME 元数据"窗口中，搜索像素大小信息。复制此数据。

对于图像校准，请转到菜单栏，然后选择图像属性。复制信息，然后单击确定。为图像指定首选的 lut。要在单个图像中可视化所有堆栈，请转到菜单栏并选择图像，堆栈，Z项目。

在显示的投影窗口中，选择可视化船只的所有堆栈。在投影类型中，选择平均强度，然后单击确定。转到菜单栏，图像，调整，亮度/对比度。单击应用并保存更改。

复制为亮度和对比度选择的参数。对于所有图像，这些图像必须相同。在菜单栏中，选择"魔杖"工具。

选择缺乏形成血管的视网膜区域。按键盘上的 T 以在 ROI 管理器中记录所选区域。单击 ROI 管理器中的测量以获取缺血区域信息。

重复这些步骤以测量视网膜的总面积。在菜单栏中，选择"魔杖"工具。放大图像以更好地可视化新血管。

使用魔杖工具逐个选择新卫星。按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。单击 ROI 管理器中的测量以获取面积数据。

在菜单栏中，选择直线工具。放大图像以更好地可视化容器壁。在第一个分支之前对主容器执行三条横向线。

按键盘上的 T 以在 ROI 管理器中记录所选区域。单击 ROI 管理器中的测量以获取距离数据。在菜单栏中，用鼠标右键单击直线工具图标，然后选择"分割线"。

在血管内从视神经开始画一条线，直到第一个血管分支，遵循血管形状。按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。在菜单栏中，选择直线工具。

从视神经开始画一条线，直到第一个血管分支。按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。单击 ROI 管理器上的测量以获取距离数据。

使用菜单栏的"椭圆"工具，定义一个同样适用于所有实验条件的区域。所选区域必须是围绕视神经绘制的同心圆。按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。

手动计算选择区域内主船产生的主要分支数量。将图像转换为 8 位模式。转到菜单栏中的插件，选择血管分析，血管密度。

使用菜单栏的"正方形"工具定义要测量容器密度的区域。单击"确定"。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在第一个实验示例中，采用了氧诱导的视网膜病变小鼠模型。

在出生后第12天进行玻璃体内注射，以确定药物作为抗血管生成的有效性。使用用载体注射的小鼠作为对照。缺血区被定义为缺乏视网膜血管的区域。

从获得的图像中，血管区域可以量化为无血管区域的总和除以视网膜的总面积。机械损坏的区域也显示没有船只。要识别受损区域，请使用Hoechst染色分析神经元层的完整性。

Neovessels是小口径血管，起源于先前存在的血管上血管。我们通过量化视网膜总面积所占据的视网膜新生血管面积来计算新血管簇占据的面积。由于新卫星的形状和大小是可变的，因此偶尔，它们看起来类似于碎片和伪影。

为了区分新血管，请验证簇是否从成熟的容器中生长。为了分析膨胀，我们测量了第一个分支之前的三个高度的主血管直径。研究人员必须定义一个预定的距离来测量容器直径，以减少结果之间的差异。

理想情况下，距视神经最远的点应在300微米左右。我们建议进行分析，然后，每种情况至少平均六只动物。关于曲折性，我们测量主血管按照其形状行进的距离，相对于视神经和第一分支点之间的直线距离。

正如我们在图像中看到的，主船的性存在异质性。为了获得具有代表性的结果，必须对每种情况进行不少于六只小鼠的定量。在表现出非增殖性视网膜病变的代谢综合征模型中分析了血管分支和密度的最新参数。

为了测量血管分支，我们通过绘制同心圆来定义定量区域，然后逐个计算主中央血管产生的初级分支。从获得的图像中，血管密度被量化为血管占用的区域除以ROI的面积，ROI位于每个显微照片中的不同位置。避免量化具有机械损坏的区域。

如果有两个以上的区域有穿刺，则必须丢弃视网膜。总之，在本文中，我们展示了经典的，成熟的和可重复的技术来量化临床实践中考虑的一些最相关的参数。