自动化秀丽隐杆线虫的聚集定量

采用一种简单的方法通过评估聚谷氨酰胺聚集并提供可用于高通量应用的框架来监测蛋白平衡的变化。对表型（例如聚合数）进行评分可能会变得主观。自动化聚合计数使我们能够消除这种偏差，提高吞吐量和可重复性。

这种方法有助于鉴定导致宿主蛋白平衡破坏的细菌基因。了解单个细菌基因的贡献将有助于我们了解其在阿尔茨海默氏症，帕金森氏症和亨廷顿舞蹈症等疾病发病机制中的含义。首先从冰箱中取出含有蠕虫的板，并让它们在室温下解冻。

然后在成像前擦去多余的冷凝物并取下盖子。使用曝光时间为500毫秒的显微镜设置，使用0.63 X相机适配器将放大倍率为40 X，在图像捕获期间将GFP强度设置为100%。现在调整透射光控制，直到蠕虫与黑暗背景相比出现明亮的照明，避免过度曝光。

通过使用10微升移液器吸头将蠕虫轻轻推入所需位置，改变孔内蠕虫的位置以防止过度结块。将通道设置为 GFP 滤光片，以便为两个图像建立焦平面。捕获明场图像。

在不干扰板或改变显微镜焦点的情况下拍摄相应的荧光图像。现在要评估图像，请先下载细胞轮廓仪。打开软件，然后将感兴趣的图像拖放到图像框中。

单击文件列表中的图像以将其打开。选择放大镜玻璃以突出显示感兴趣的区域，选择箭头图标以测量蠕虫和聚集体的长度。将鼠标悬停在所需对象上以确定其强度值，该值可在屏幕底部看到。

要利用细胞轮廓图像分析管道，请在从官方网站下载细胞轮廓后，按照文本手稿中所述正确命名图像对。下载管道，并通过从文件中选择文件、导入和管道将其上传到单元格配置文件中。选择解缠蠕虫模块以打开其设置，以加载用于在未缠结蠕虫模块中识别蠕虫的训练集。

然后确定训练集文件名。选择上传文件图标并上传补充文件。通过选择左上角的图像模块上传图像。

然后拖放正确命名的图像。在分析图像之前，通过单击位于程序左下角附近的输出设置按钮，选择将用于存储结果的所需输出文件夹。然后选择默认输出右侧的文件夹图标以选择所需的输出位置。

选择分析图像图标以开始图像分析。如果分析完成时间过长，并且在处理单个图像时卡住，则中止运行并通过对输出文件夹进行排序并记下找不到哪个图像名称来识别未处理的图像。完成分析后，软件会将结果组织到一个Excel电子表格中，其中包含N列中的单个蠕虫，以及K列中相应的聚合数。

对于 Windows 操作系统，请找到下载的文件并将其解压缩到所需位置。找到并打开名为 gui_Windowsos_64x 的解压缩文件夹。然后通过单击GUI应用程序图标启动应用程序。

可能会打开一个提示，请求运行权限。选择更多信息，然后单击"仍然运行"。元数据管理器现在已准备好拖放单元格配置文件输出 CSV 文件。

对于 Mac OS，找到下载的文件并解压缩文件元数据管理器应用程序文件。打开下载中找到的解压缩文件夹。右键单击 GUI 应用程序，然后选择"打开"。

将出现一个提示，要求允许打开，因为缺少官方许可证。选择"打开"。在相应的操作系统中打开元数据管理器应用程序后，单击此处上传文件，或拖放所需的单元格配置文件CSV文件。

单击组织按钮，这将把用户带到一个带有下载文件按钮的新屏幕。单击该按钮并选择所需的位置以保存输出文件。输出文件将显示为原始文件名，并在文件名中添加了_organized扩展名。

在FUDR的存在下，喂养各种细菌的蠕虫具有更一致的体型，可以更均匀，更准确地检测蠕虫，从而解决过度拥挤的问题。冷冻蠕虫通过消除背景荧光以及可与手动计数相媲美的自动计数的准确性，改进了polyQ聚集体检测。采用倒置明场照明检测整个秀丽隐杆线虫和GFP通道，对polyQ YFP聚集体进行成像。

通过应用优化的 CellProfiler 图像处理管道，对每个蠕虫进行蠕虫检测、解开缠结和聚合定量，该管道允许获取每个蠕虫的聚合数。自动聚合定量与使用CellProfiler管道的功效之间的差异很小，这表明该自动化方法可以应用于大规模屏幕。在测试的90种细菌菌株中，具有一种候选者的秀丽隐杆线虫肠道定植显示出聚集体数量的显着减少。

通过手动计数进行的确认实验表明，没有一个突变体，包括显着减少聚集体数量的突变体影响polyQ聚集体。决定使用此框架的研究人员应该明白，概述的步骤不是绝对的。修改和基本了解如何操作细胞轮廓对于成功至关重要。

其他生化方法（如蛋白质印迹）可用于确认 polyQ 聚集。