使用胺还原甲基化进行样品制备和相对定量，用于肽学研究

在这里，我们描述了一种基于蛋白酶快速热灭活的教学方法，以保留天然细胞内肽，避免细胞和组织中的降解，然后使用同位素标记对肽进行相对定量。这种标记方法具有很多优点。这些试剂是市售的，价格低廉，化学稳定，并且可以在单个血清中分析多达五个样品。

首先在含有15%FBS和1%青霉素链霉素的DMEM中培养人神经母细胞瘤细胞。将细胞保持在37摄氏度，低于5%的二氧化碳。用PBS洗涤细胞两次，然后加入10毫升PBS，刮擦细胞，并将它们收集到15毫升的管中。

以800倍G离心细胞五分钟，并除去上清液。将沉淀重悬于一毫升80摄氏度的超纯去离子水中，然后将管的内容物转移到两毫升的微量离心管中。对斑马鱼进行热灭活后，将整个大脑收集在两毫升的微型管中，并将其冷冻在零下80摄氏度，直到分析。

将组织样品重悬于1毫升80摄氏度的超纯去离子水中，并使用30个脉冲1秒用探针超声处理。将细胞裂解物或匀浆组织在80摄氏度下孵育20分钟，然后在冰上冷却10至30分钟。每1毫升样品体积加入10微升一摩尔盐酸储备溶液。

涡旋混合20秒，在冰上孵育15分钟。将细胞裂解物或匀浆组织以12， 000 g的4摄氏度离心15分钟。将上清液收集在低结合蛋白微量离心管中，并将其储存在零下80摄氏度。

用水清洗超滤装置，以2， 300倍G离心三分钟，然后丢弃超滤装置中的水。将上清液移入预洗的10千尔顿截止过滤器中，并在4摄氏度的冷藏离心机中旋转。检查样品的pH值。

用一毫升100%乙腈平衡色谱柱，然后用一毫升5%乙腈和0.1%三氟乙酸洗涤。将样品的完整体积装入柱中，并用一毫升5%乙腈和0.1%三氟乙酸洗涤柱。用1.8毫升1%乙腈和0.15%三氟乙酸将柱中的肽洗脱到蛋白质低结合微量离心管中。

将样品完全在30摄氏度的真空离心机中干燥，并监测显示的浓缩时间。将样品储存在零下80摄氏度。将肽样品重悬于100至200微升超纯水中，并将2.5微升标准肽浓度的移液管和样品悬浮到白色96孔板上。

加入25微升0.2摩尔磷酸盐缓冲液和12.5微升荧光胺。在轨道旋转器上轻轻匀定一分钟。接下来，加入110微升水以停止反应。

调整光谱仪上的设置，然后读取平板。向每个肽样品中加入1/10体积的一摩尔三甲基溴化铵，最多25微克肽。确保pH值在5到8之间，如果需要，用盐酸或氢氧化钠调节。

加入四微升非氘代、氘代甲醛或碳-13氘化甲醛。通过涡旋混合五秒钟。向肽样品中加入四微升氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠。

然后通过涡旋将样品混合五秒钟。将肽样品在室温下在通风橱中孵育两小时，每30分钟涡旋一次。重复加入非氘代、氘代或碳-13氘代甲醛和氰基硼氢化钠或氘化氰基硼氢化钠，每次加入后涡旋。

将样品在室温下在通风橱中孵育过夜。加入16微升碳酸氢铵，涡旋混合。将样品放在冰上。

加入八微升5%甲酸，再涡旋五秒钟。将肽样品混合，在2到4之间调节pH值，然后使用乙腈和三氟乙酸在反相净化柱上脱盐组合样品，如前所述。将样品完全在30摄氏度的真空离心机中干燥，然后将其储存在零下20摄氏度。

使用质谱观察标记的肽。红色箭头表示存在用两种同位素形式L1和L5标记的不同肽的峰对，分别用于两个不同样品S1和S2之间的比较。此处显示了分别用L1，L3和L5标记标记的三种不同样品S1，S2和S3中存在的肽的质谱。

进行了四链体标记。分别用L1和L3标记对照样品S1和S3，与两个实验样品S2和S4分别用L2标记和 L4.No 差异进行比较。同位素标记用于在体外显示给定蛋白酶或肽酶的产物中的底物。

这里显示了在神经溶素酶存在下不会改变的肽。在酶存在下消失或减少的肽是底物，而那些增加的肽被认为是产物。该图是识别由标有三种不同形式标签的数据库搜索引擎执行的肽序列的示例。

在定义之前，请确保样品完全冷却，以避免硬酸化引起的肽键断裂。此外，超滤设备的清洁至关重要。质谱法是一种极好的方法，可以量化不同实验条件之间的肽，并通过鉴定肽酶底物进行分析研究。