树脂辅助捕获与同量异位串联质量标签标记相结合，用于蛋白质硫醇氧化的多重定量

该协议描述了一种能够对蛋白质的氧化胱氨酸残基进行位点特异性鉴定的方法。该方法允许从各种样品类型中生成氧化胱氨酸残基的定量和位点特异性数据。要开始辅助捕获程序，用丙酮在4摄氏度下以20，500G离心10分钟，用丙酮洗涤沉淀的蛋白质沉淀两次。

然后倒出丙酮并用微量移液管除去剩余的丙酮。使用玻璃血清移液管向试管中加入三毫升新鲜冰冷的丙酮，并通过将试管倒置几次来充分混合。第二次洗涤后，让颗粒风干一到两分钟，不要让它们过度干燥。

向干燥的蛋白质沉淀中加入一毫升缓冲液B。为了溶解蛋白质，在输出为250瓦的浴超声仪中重复超声处理沉淀，一次15至30秒，同时进行短暂的涡旋。进行二辛可宁酸或BCA测定以测量蛋白质浓度。

为了标准化蛋白质浓度，将500微克蛋白质样品转移到0.5毫升，10千道尔顿离心过滤器中，并用重悬缓冲液将样品体积增加到500微升。在室温下以14， 000g离心蛋白质缓冲混合物，直到离心过滤器中的体积小于100微升。通过在收集管中反转过滤器来收集样品。

将样品以 1000 G 离心两分钟，然后加入缓冲液 C 以获得 500 微升的最终体积。为了减少蛋白质硫醇，向样品中加入20微升500毫摩尔二硫苏糖醇或DTT，以获得20毫摩尔的终浓度，并将样品在37摄氏度下孵育30分钟，并以850RPM振荡。还原后，将样品在室温下以14， 000 G离心至0.5毫升10千道尔顿离心过滤器中，直到离心过滤器中的体积小于100微升。

加入缓冲液D以将体积补足至500微升并重复离心。第四次离心后，通过将过滤器倒置在收集管中以 1000 G 离心两分钟来收集样品。然后使用BCA测定法测量蛋白质浓度。

接下来，将离心柱放在真空歧管上，并使用微量移液器将500微升新鲜制备的硫醇亲和树脂浆液转移到每根色谱柱上。应用真空去除水分。重复该过程一次，每根色谱柱获得30毫克树脂。

用500微升超纯水洗涤树脂五次，通过施加真空除去水，然后用500微升缓冲液 E.In 新管中洗涤树脂五次，将缓冲液C添加到150微克还原的蛋白质样品中，直到最终体积为120微升。将蛋白质溶液转移到含有树脂的堵塞离心柱中。将盖子放在色谱柱上，在室温下以850rpm振荡孵育两小时。

按照手稿中的说明清洗树脂。更换插头。为了进行树脂上的胰蛋白酶消化，向样品中加入120微升新鲜制备的胰蛋白酶溶液，并将色谱柱在37摄氏度下孵育过夜，并以850RPM振荡。

第二天，按照手稿中的说明多次清洗树脂并更换塞子。使用微量移液器，向洗涤的树脂中加入40微升100毫摩尔三乙基碳酸氢铵缓冲液。然后加入70微升溶解的串联质量标签或TMT标记试剂，并在室温下以850RPM振荡孵育一小时。

将任何剩余的TMT试剂储存在零下80摄氏度。清洗树脂并更换插头。通过向色谱柱中加入100 μL pH 8.0的100毫摩尔碳酸氢铵缓冲液（含有20毫摩尔DTT），并将色谱柱在室温下以850 RPM孵育30分钟，洗脱TMT标记的肽。

孵育后，通过将色谱柱放在真空歧管上，施加真空并将样品洗脱到5毫升微量离心管中进行洗脱。重复该步骤一次，然后向色谱柱中加入100微升含有0.1%三氟乙酸的80%乙腈。在室温下孵育色谱柱10分钟后，将样品洗脱在相同的5毫升离心管中。

将洗脱的样品放入真空浓缩器中直至干燥。然后将干肽储存在零下80摄氏度，直到进一步使用。使用SDS-PAGE对来自RAW 264.7细胞的肽样品进行定性分析，其中通过确定处理引起的不同氧化水平来比较样品。

随后通过蛋白质印迹探测分离的蛋白质，以进一步研究单个蛋白质的氧化水平。报道的含胱氨酸肽的离子强度通过液相色谱串联质谱分析。对iTRAQ的硫醇氧化化学计量，在单个胱氨酸位点水平标记的富集和氧化肽进行定量。

小心地去除丙酮，不要干扰蛋白质沉淀。确保蛋白质沉淀完全溶解和精确定量，并将树脂准确分配到离心柱。确保在洗涤步骤中重悬树脂。

可通过SDS-PAGE和染色、蛋白质印迹和质谱法对富集蛋白质和肽进行进一步评估。