可靠地工程和控制哺乳动物细胞中稳定的光遗传学基因回路

标准化的光遗传学方案专为有兴趣使用光作为刺激来控制工程哺乳动物细胞系统中的细胞特性的实验室而设计。该协议易于在不熟悉光遗传学的实验室中实施，并为工程生物系统的精确时空控制提供了方法。该方法在特定研究领域具有广泛的应用，其中时空信息可能很重要，包括癌症生物学，系统生物学和组织分化。

首先，选择遗传成分以结合成单个基因回路或质粒。例如，哺乳动物DNA整合位点、光响应元件或功能基因。在组装和检查所有必要的特征（如起始密码子，调控或翻译序列）后，使用任何基因工程和分子克隆软件，注释和存储DNA序列以供以后使用并作为参考。

通过内置的分子克隆软件功能（例如，序列比对）以计算方式验证质粒构建的引物。为了产生稳定的细胞系，请使用基因电路DNA的脂质体混合物和适当的重组酶转染设计基因电路和所需细胞。细胞汇合80%至100%后，将细胞冷冻在45%旧培养基，45%新鲜培养基和10%DMSO的混合物中。

将剩余细胞转移到无菌管中并进行单细胞分选，以将单克隆细胞分离到96孔板中。单克隆分选后约两到三周，96孔板内的孔应具有病灶。当达到50%至60%的汇合度时，将细胞分裂成12孔板。

使用微控制器编程器将固件添加到组装的LPA电路中。接下来，使用安装板，电路板，LED垫片，板适配器，24孔板，板盖，安装螺栓，翼形螺母和堆叠组件将3D打印部件组合在组装的电路板中。要开始光遗传学实验，请使用Tabor Lab网站上提供的Iris软件为LPA编程SD卡并探索适当的光照条件。

接下来，输入强度值以及所需实验大纲的技术仿制品。在总体积为500微升的24孔黑板中每孔添加约75， 000个细胞，然后将细胞置于具有5%二氧化碳的加湿培养箱中，使它们沉降两到六个小时。在孵育结束时将细胞转移到组织培养罩中后，取下塑料盖并将粘合箔条添加到板的顶部，以最大限度地减少孔之间的光转移，以便光只能通过位于孔底部的LED进入。

将板放在LPA的安装3D部件中，然后用3D打印的LPA盖子覆盖板，该盖子适合每个角落上的设备螺钉。将器件插入电源，然后按下LPA器件上的复位按钮，以确保应用更新的LPA实验设置并孵育细胞。孵育后，在组织培养罩内，从板上取下铝箔条，让板静置一到两分钟，以防止在塑料盖上形成冷凝。

接下来，将原始塑料盖放回板上，并用适当的相差或荧光显微镜对细胞进行成像。诱导后24至72小时后，然后胰蛋白酶消化，将每个孔中约500微升的全部内容物转移到装有细胞过滤器的标记管中。然后使用适当的流式细胞术仪器软件，创建一个正向和侧面散射门，以捕获适当大小和粒度的单个细胞，以排除碎片和细胞团块。

设置门后，使用适当的门捕获大约10， 000个细胞，并根据所需的细胞数据量调整细胞数量，并在每个管中重复捕获实验细胞。诱导和胰蛋白酶消化后，将每个孔中约500微升的全部内容物转移到标记的管中。在丢弃上清液后，将细胞以400倍G离心五分钟，将样品移至化学通风橱中。

将细胞重悬于750至1， 000微升4%PFA稀释在PBS中，并上下移液几次以破坏细胞团块。孵育15分钟后，加入750至1， 000微升PBS，并再次上下移液几次，然后在室温下以400倍G下沉淀细胞5分钟。丢弃上清液后，将样品移至化学通风橱，并将细胞重悬于750至1， 000微升冰冷甲醇中，如图所示，并允许细胞在零下20摄氏度的冰箱中静置30分钟。

孵育后，加入750至1， 000微升PBS，同时通过上下移液几次。然后在以400倍G离心细胞五分钟后，丢弃上清液并将样品移动到化学通风橱中。将细胞重悬于100微升或其他合适的标记一抗稀释液中，上下移液6至8次，然后在室温下孵育一小时。

接下来，上下加入750至1， 000微升的孵育缓冲液和移液器溶液，然后以400次G.Next离心细胞五分钟，将细胞重悬于500微升PBS中，并通过上下移液几次来破坏团块。将每个管的全部内容物转移到带有细胞过滤器的标记管中。将细胞带到具有正确波长激光的适当流式细胞术仪器。

对设备进行了光学校准。利用采集到的图像，计算LED的补偿值，减去背景信号，推导像素强度。96口井之间的变异系数最小。

校准软件按位置演示了 LED 的变化，并创建了灰度调整，以便每个 LED 都归一化为相同的强度。通过荧光显微镜在LPA上以不同的光脉冲持续时间在工程化的较轻细胞中诱导基因表达，并对细胞进行明场和GFP表达成像。使用流式细胞术，在不同的脉冲长度值下诱导细胞，并显示出在群体水平上定量的基因表达的剂量反应，与未诱导状态相比变化超过四倍。

负反馈实现了超过五倍的基因表达降噪，通过比较较轻系统与生动或亮起的各种光强度值来显示。qPCR分析表明，工程化的较轻细胞以剂量响应的方式表达RNA水平，从未诱导状态诱导超过十倍，与流式细胞术定量相匹配。工程化的较轻基因电路显示蓝光量增加，导致KRAS蛋白水平升高和磷酸化ERK水平升高。

可以进行多种功能测定，包括生长，细胞活力，伤口愈合，增殖或侵袭测定。这些方法可以为癌症生物学，组织分化或耐药性的机制提供具体的见解。