使用机器人微注射操作脑片中单神经干细胞和神经元

这种技术使得对活组织中的单个细胞有更近距离的查看成为可能。通过跟踪和操纵单个细胞，我们可以更好地了解发育过程中的组织形成。此方法的可视化演示使潜在用户能够决定此技术是否有助于他们的工作。

此外，它使用户能够看到应用程序的运行，这将是很难从文本单独掌握。该协议可应用于每个具有可评估表面的组织。我们一直针对同一组织中的不同细胞，同一物种的不同组织，也针对不同的物种。

尝试此协议时，保持专注并快速工作非常重要。在开始解剖之前，应准备好所有设备。首先安装自动喷油器软件，然后用微管拉拔器从硅酸盐玻璃毛细管中拉出微注射移液器。

将移液器存放长达三天，防止灰尘。使用微波炉熔化3%宽的葡萄糖。不要让水糖在37摄氏度的水浴中凝固。

使用水浴将 10 至 12 毫升 SIM 卡和 20 毫升 Tyrode 溶液的等分解冻至 37 摄氏度。将荧光示踪剂与其他要注射的化学物质混合，然后在16，000次G下将微注射溶液离心，在4摄氏度下30分钟。收集上一液，并转移到一个新的管。

将微注射溶液放在冰上直到使用。使用从E13.5到E16.5小鼠胚胎的头来准备脑电图的器官组织切片。去除皮肤，打开头骨，钳子沿着中线移动。

从开放的头骨中解剖胚胎大脑，从大脑的腹侧取出覆盖脑组织的脑管。将解剖的整个大脑留在泰洛德的溶液中，放在37摄氏度的加热块上。将广范围熔化的阿加罗斯倒入一次性嵌入模具中。

当它冷却到38至39摄氏度时，使用巴斯德移液器小心地将多达四个大脑转移到红糖中。用铲子或一对杜蒙头号钳子搅拌组织周围的阿加罗斯，无需接触组织。让加糖在室温下凝固。

一旦糖凝固，修剪组织周围的多余的。用 PBS 填充缓冲纸盒。用垂直于托盘的组织旋转轴定向大脑，并使用振动器切割 250 微米切片。

用两毫升预热介质填充 3.5 厘米 Petri 盘，然后使用塑料巴斯德移液器将 10 至 15 片转移到此盘中。完成后，将带切片的培养皿转移到切片培养箱中。在加湿的大气中将切片保持在 37 摄氏度。

打开计算机、显微镜、显微镜相机、操纵器、压力钻机和压力传感器。通过单击文件加载应用程序，启动应用程序.py从 GitHub 下载的主文件夹中，并在弹出窗口中指定设备设置。

为防止不必要的堵塞，在将移液器淹没到溶液中之前，请创建向外压力。将补偿压力条滑动到 24 到 45%，然后单击设置值。接下来，将机械压力阀旋钮转动为压力传感器指示的一到两个 PSI 来调整压力。

将切片转移到包含两毫升预热 SIM 卡的 3.5 厘米 Petri 盘的中心，然后将 Petri 盘放在已预热至 37 摄氏度的微注射阶段。使用长尖端塑料移液器用 1.4 至 1.6 微升微注射液加载微注射移液器，并将微注射移液器插入移液器支架。使用显微镜上的最低放大倍率，将切片对焦，并引导微移子进入此视场，以便它聚焦在与切片目标相同的平面上。

将显微镜的输出切换到摄像机以查看 FOV 和应用。单击界面左上角的放大按钮以启动设备校准。当窗口提示选择放大倍率时，选择 10 倍并按"确定"。该软件假设内部客观透镜是10倍。

使用显微镜的微量滚轮重新聚焦移液器尖端，然后用光标单击移液器尖端。接下来，按步骤 1.1 按钮，然后按弹出窗口中的"确定"。移液器将朝着 y 方向移动。

单击移液器的尖端，然后按步骤 1.2 按钮。最后，在移液器角度框中输入 45 并按设定角度。在自动微注射控制面板中输入所需参数，并在完成时将速度设置为 100%，单击"设置值"。

单击绘制边缘按钮，然后沿弹出窗口中所需的轨迹拖动光标以定义喷射轨迹。对于微输入神经元，瞄准脑电图的基底侧。将移液器带到行的开始，然后单击其提示，然后单击运行轨迹以开始微提示。

对所针对的每个注射平面重复此步骤。将切片浸入胶原蛋白混合物中，然后将切片与 200 至 300 微升胶原蛋白一起转移到 35 毫米玻璃底盘的 14 毫米井中。确保切片覆盖在尽可能少量的胶原蛋白中，这是营养和氧气吸收的最佳条件。

使用两对钳子对切片进行定向，并在加热块上孵育 Petri 盘在 37 摄氏度下孵育 5 分钟，使胶原蛋白凝固。将培养皿移回切片培养箱40分钟，然后加入两毫升预热SCM。在培养结束时，从切片培养箱中取出切片，并吸出 SCM。

用PBS清洗胶原蛋白嵌入切片，然后加入4%的甲醛，将组织留在室温下30分钟。将温度移动到四摄氏度，进行过夜固定。第二天，吸气的甲醛溶液，用PBS清洗切片。

在立体显微镜下使用两对钳子从胶原蛋白中去除切片。使用微波炉熔化3%的低熔点，然后倒入一次性嵌入模具，让它冷却到大约38或39摄氏度。将组织切片转移到此模具中，确保切片的剥离侧朝上，然后让糖冷却到室温并凝固。

修剪切片周围的额外加糖。定向 agarose 块，确保切割表面与振动器的切割刀片平行，并切割 50 微米厚的部分。用 PBS 填充 24 井的盘子，然后用细尖画笔将部分转移到该盘中，然后根据标准协议进行免疫荧光。

此处显示了成功注射的祖细胞和新生神经元的代表性图像。当注射德斯特兰亚历克萨488时，细胞似乎充满了染料。与手动微注射相比，自动微注射可提供更高的吞吐量。

此外，EDU 标签确认细胞生存能力不受自动化的影响。在培养物中保持有机细胞切片，可以跟踪微基因细胞的血统进展。对单神经干细胞的微注射提供了出色的单细胞分辨率。

因此，它被用来剖析神经干细胞进展和命运转变的细胞生物学。该协议用于研究新生儿神经元的交联耦合，注射路西法黄色与Dextran A555。一部分新生的金字塔神经元通过间隙结耦合到相邻神经元，这与不成熟的神经元通过间隙结进行交流的想法一致。

我们利用这种技术来研究大脑发育和大脑进化的细胞生物学。我们研究了几个影响神经干细胞行为的候选基因，我们能够发现并理解它们是如何工作的，它们如何影响神经干细胞系的遗传进展，以及大脑发育期间的神经元产生。