人类自然杀手细胞代谢分析

这种方法允许确定自然杀手细胞代谢。通过测量细胞外介质中的耗氧量和 pH 变化，激活的关键参数。细胞外通量分析仪的优点是，它是全自动的，能够用少量的细胞实时测试多达92个样品。

因此，允许高吞吐量屏幕。一种确定糖解和呼吸在墨水细胞的有效方法在临床上非常重要。因为有许多疾病，包括肥胖和癌症，其中墨水细胞代谢受损。

首先将20毫升淋巴细胞分离介质移液到50毫升锥形管中。保持管在30度角，轻轻地移液20毫升的血液在介质。在两种流体之间创建一个可见且定义良好的接口。

在1000次G下将管子离心25分钟，然后小心地将管子从离心机中拿出并放在机架中。检查 LSM 和等离子体之间的接口上是否存在明显的细胞层。用10毫升塑料移液器轻轻吸制单核细胞层，并放在新的50毫升锥形管中。

用45毫升PBS清洗单核细胞两次。并在800次G下离心5分钟。要分离自然杀伤细胞或基因，数一数PVM海洋，并在NK分离缓冲液中重新暂停，每毫升10至第八细胞。

然后将10毫升的细胞悬浮液转移到新的50毫升管中。加入500微升NK细胞分离抗体混合物。和10微升抗CD三阳性分离抗体混合到PBMC。

并在室温下孵育10分钟。漩涡磁珠，并添加一毫升到PBMC和抗体。然后在室温下孵育MIGS10分钟，偶尔搅拌。

加入 35 毫升 NK 隔离缓冲液，将管子放在磁铁上 15 分钟。使用 50 毫升塑料移液器小心收集上清液，无需接触管的两侧或底部。数数细胞，并在800次G下离心5分钟。

为了用可溶性通道15刺激NK细胞，在96孔板的井中，在100微升的 IMDM 中重新发送75万个细胞，其中含有10%HS。在 IMDM 中稀释人类通道 15 至 1 微克/毫升和 10%HS。并在细胞中加入100微升稀释的人类通道15。

使用未刺激的细胞修复控制样品，并在 37 摄氏度的培养箱中放置两个样品。刺激细胞48小时，然后进行细胞外通量测定。实验前一天，打开分析仪，让它加热到37摄氏度。

打开检查器盒包，将墨盒与公用用板分离。然后向公用板的每个井中加入 200 微升的校准液。将中央墨盒放回原，确保传感器完全被淹没。

为了获得最佳效果，在无二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵化墨盒过夜。适当加湿。要准备胶粘剂涂层刀片，移液器 25 微升的细胞粘合剂溶液到板的每个井。

并在室温下孵育20分钟。然后取出溶液，用每井200微升无菌水清洗板两次。将板在细胞培养罩内保持 15 分钟打开，使水井干燥。

将先前分离的NK细胞离心，将G增加200倍，五分钟。然后去除超天然，在温暖的线粒体压力测试介质或糖解压力测试介质中清洗细胞。再次将细胞取出，然后将它们重新暂停到同一介质中的首选细胞浓度。

将每井180微升的细胞悬浮液放入检测板中。使用井 A 一、A 12 H 1 和 H 12 作为背景校正的控制井。在这些威尔斯中加入180微升的检测介质，在37摄氏度的温度下在无二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。

将板在 200 次 G 下离心五分钟。然后在显微镜下观察细胞，检查它们在井底形成一个毛层。再孵育细胞25分钟。

温暖工作解决方案至37摄氏度。如果需要，将pH重新调整为7.4。将先前准备的化合物加载用于线粒体应激测试或糖解应激测试，放入水合审查盒的板 A、B 和 C 中，在设置程序时将加载的检查器盒放回培养箱中。

要设置细胞外通量测定协议，请打开软件并使用组定义来定义预处理条件。使用"板贴图"选项卡指示具有类似条件的井组也指示背景校正和空井。然后在协议选项卡中设置程序。

启动程序，将传感器墨盒和公用电源板放在托盘上。校准步骤后，将检测板的校准板更换为附着的电池。运行完成后，检索数据并对其进行分析。

为了评估NK细胞的纯度和可行性。来自PVM海洋的小亚历克瓦和孤立的NK细胞群体被染色，并经流式细胞测定分析。NK细胞的纯度是由双停留对CD三和CD56或NKP46。

此处显示了人类NK细胞的线粒体耗氧率。如预期的那样，I 单元格号显示较高的 OCR 值。细胞数也与井中的DNA或蛋白质量呈线性关联。

另一方面，较高的细胞数不是最佳的。因为加入DNP后，井中的氧浓度在每个周期中完全耗尽。这妨碍了OCR的准确计算。

在人类NK细胞中，100微摩尔DNP被发现是最佳剂量。此处显示了一个典型的线粒体压力测试实验，每孔有 75 万个 NK 细胞。在这个测试中，寡霉素导致氧气消耗的急剧下降。

和增加ECAR。这表示对糖解的转换和保持细胞 ATP 水平的努力。NK细胞通过通道15的激活导致线粒体耗氧量和细胞外酸化增加。

基础最大和ATP链接呼吸增加，但不是质子泄漏或非线粒体呼吸。此外，OCR/ECA率下降表明在IL 15刺激后向糖解代谢转变。执行此协议时，获得纯健康细胞组以确定最佳细胞数和滴定不可控制器的浓度非常重要。