功能性与极化胆囊肿的生成与定量特征

这是生成胆道囊肿的第一个协议，提供系统分析，允许随着时间的推移评估囊肿的形成、效率和大小。此方法允许对上皮囊肿形成进行定量评估，并使得可以评估这一过程作为上皮细胞或水凝胶类型的函数。由于胆道疾病的治疗选择有限，该协议为标准化药物研究、确定正常的治疗靶点和了解疾病机制打开了大门。

简单的方法可以解决管状结构领域生物工程中新信息机制的重要问题。在开始实验之前，在4摄氏度下解冻适当的水凝胶溶液，并在零下20摄氏度的一夜之间解冻预冷移液器尖端和8井室滑动。第二天早上，将水凝胶和八井室滑轨放在冰上，在冷普通大鼠胆囊细胞完整介质中加入适当体积的水凝胶，获得500微升40%水凝胶溶液。

然后使用冷移液器尖端将 50 微升水凝胶溶液添加到腔室滑轨的每个井的中心，并使用移液器尖端将溶液尽可能均匀地铺在井底的整个表面上，而不会产生气泡。为准备实验细胞，当水凝胶聚合时，用预热的PBS清洗70%汇合正常大鼠胆血管细胞培养中的细胞，并在细胞培养培养箱中用5毫升新鲜预加热PBS孵育细胞20分钟。在孵育结束时，用一毫升预加热的 Trypsin-EDTA 更换PBS，将烧瓶返回细胞培养箱5至10分钟。

当细胞分离时，用四毫升预热完全正常的大鼠胆黄细胞介质中和反应，将细胞转移到15毫升管中离心。然后将颗粒重新悬浮在五毫升预热介质中，并通过 40 微米滤株将细胞过滤到 50 毫升管中进行计数。要产生囊肿，将适当体积的水凝胶加入冷完全正常大鼠胆囊细胞介质中，在1，600微升的介质中获得1，600微升的80%水凝胶溶液，并将细胞稀释至每毫升冷完全正常大鼠胆细胞介质浓度的5倍至第5个细胞。

立即混合细胞和水凝胶细胞溶液，并在水凝胶涂层室滑轨的每个井中加入400微升的细胞，注意避免气泡。为确保获得可重复和显著的结果，请务必小心处理水凝胶，并彻底混合初始细胞氢溶液，以获得均质溶液。当所有细胞都播种后，将幻灯片放在细胞培养箱中。

在培养两天后，从每一个井的一角取出250微升的介质，注意不要冲洗水凝胶，并慢慢用250微升的新鲜培养基取代废弃的下一杯。对于囊肿成像，在适当的培养日，在配备图像采集软件的相位对比度显微镜上选择 10 X 目标，打开白灯并选择亮场成像选项。选择播放以打开相机并聚焦囊肿领域。

设置曝光时间并打开自动捕获文件夹窗口，以允许自动保存图像。打开捕获 Z 系列窗口，重置默认位置，并使用 Z 形螺钉定义 Z 堆栈的顶部和底部平原，根据目标和分辨率级别调整 Z 步数。然后单击"立即运行"以启动采集。

映像后，打开斐济的 Z 堆栈。要复制堆栈，请单击图像、重复和复制堆栈。若要从重复的堆栈创建最小强度投影，请在图像菜单下选择堆栈和 Z 项目。

选择投影类型的最小强度，然后单击"确定"。要从投影中减去背景，请在过程菜单下选择减去背景并选择 500 像素的滚动球半径和浅色背景，以使囊肿比背景更对比度。要测量近似囊肿直径，请缩放目标囊肿，选择直线工具，然后按键盘上的 T 按钮。

在最终投影上绘制一条穿过每个囊肿直径的线。为每个囊肿创建的下一个感兴趣区域将添加到兴趣管理器区域。计算所有囊肿后，单击 Z 堆栈窗口以选择它，然后单击"全部显示"以查看计数囊肿。

沿 Z 堆栈移动光标，检查每个图像中是否计算了所有囊肿，并尽可能向兴趣管理器区域添加新囊肿。计算所有囊肿后，选择感兴趣区域集并单击更多并保存以保存数据。要确定每个囊肿的大小，在仍选择感兴趣区域时，请单击"度量"。

将显示一个窗口，列出每个囊肿及其估计大小。然后以 CSV 格式保存数据。如所证明，记录囊肿的数量和它们各自的大小随着时间的推移，可以分析囊肿的形成和生长的演变。

起始细胞组和10天大囊肿的可行性可以通过活体/死染色来评估。死亡细胞在第10天占细胞总数的不到3%，大多以分离细胞或小聚集物形式位于囊肿之外，尽管在一些大囊肿中观察到一些坏死细胞碎片堆积。与氟化物和霍奇斯特的孵化允许评估氟化物从基底到腹腔发光空间的形成和分泌。

值得注意的是，使用多药耐药抑制剂进行预处理抑制氟雷丝素的分泌，表明流明中荧光氟素的积累是由于通过耐多药的运输器分泌的，而不是从细胞间空间泄漏的。E-cadherin表达的染色显示，正常的大鼠胆血管细胞在水凝胶中保持其上皮表型至少10天。在准备供免疫荧光评估的囊肿时，在饱和期间将牛血清白蛋白保持在0.1%或更少是保持囊肿完整性的关键，因为较高的浓度会导致囊肿缩回和流明崩溃。

隔夜水凝胶、解冻、移液器尖端和腔室滑动记录、在冰上工作以及均匀地将同源细胞水凝胶混合物均匀地扩散到培养室滑轨上，都是实验成功的关键。此方法可用于产生来自其他上皮细胞或水凝胶的囊肿，从而可以比较，从而更好地了解上皮极化。这种定量方法可用于测试药物或基因突变对胆道功能和器官生成的影响。