在全融合微流体平台中增强患者衍生异种移植物的外体 3D 水凝胶培养物的生存能力

改进患者衍生肿瘤样本的培养方法至关重要，因为该领域正在远离传统细胞系的使用。该协议允许在一个平台中培养患者衍生的肿瘤细胞，该平台可经得起高吞吐量和高含量筛选，与体内癌症模型不同。结合PDX的平台使我们能够评估更多反映原生肿瘤的异质系统。

这可能使人们了解药物机制，并允许更快的药物筛选。该方法可以通过结合频闪、内皮和免疫细胞来扩展。这些共培养物可以更反映本地肿瘤种群和结构。

练习用易于扩展的细胞系加载微流体板，在转移到 PDX 等更珍贵的细胞之前变得高度熟练。 在板点胶过程中进行对齐会极大地影响成功，视觉演示可以轻松传达这一概念。首先，将肿瘤组织转移到预称无菌的50毫升锥形管。

用 30 毫升无菌 PBS 冲洗六次，以去除血液和污染物。去除尽可能多的液体，并称重肿瘤组织。将肿瘤组织转移到60毫米圆形组织培养皿中，并使用无菌剃刀刀片或手术刀将其切碎成1毫米。

加入五毫升PDX加工介质，收集肿瘤浆料。加入五毫升分离酶溶液，收集肿瘤浆料。用另外五毫升分离酶溶液冲洗培养皿。

然后添加五毫升的PDX处理介质。在37摄氏度下孵育20分钟，轻轻摇晃。孵育时间过半，轻轻旋转管子。

孵育后，移液器上下轻轻与血清移液器，以打破团块。将70微米细胞滤株放在新的无菌50毫升管上，然后过滤细胞。然后在 1，200 rpm 时离心两分钟，对细胞进行分粒。

在两到三毫升的PDX培养介质中去除上一除和重新暂停。使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。使用此表可以估计实现每个芯片所需的所需单元所需的相关 PDX 派生单元数。

六井组织培养板每井的五毫升PDX培养中，将一至二倍的六个细胞板。在37摄氏度、5%的二氧化碳和95%的湿度下孵育48小时，在50至55转/小时轻轻摇晃，促进聚类形成。集群形成后，继续离心。

首先，在无菌的 50 毫升锥形管中，将 18 毫升密度梯度离心溶液与两毫升无菌 10X HBSS 彻底混合，准备 20 毫升 100% 密度梯度溶液。用无菌 1X HBSS 稀释此 100% 溶液，使 10 毫升各 20%30%40%和 55% 密度梯度溶液。在 15 毫升锥形管的底部加入三毫升 55% 密度梯度溶液。

以一定角度握住管子，缓慢地将三毫升40%密度梯度溶液分配到管子的倾斜侧和55%层的顶部。使用 30% 密度梯度解决方案重复。然后用五毫升血清移液器将PDX旋转培养物的上一级收集到管子中，轻轻冲洗板表面。

在 1，200 rpm 转速下离心两分钟，以产生细胞颗粒。去除上一提液，将细胞颗粒重新在三毫升20%密度梯度溶液中。小心地将 20% 密度梯度溶液与细胞分层到 15 毫升管中的梯度顶部。

在4摄氏度、2000倍G和零破度下，将管子和离心机盖住在回转桶转子离心机中30分钟。离心后，分数是可见的。可行的 PDX 细胞培养物通常位于 40 到 55% 密度梯度解决方案接口。

将每分数的两到三毫升收集到新鲜的 15 毫升管中。在每个分数中加入三到四卷无菌 1X HBSS，然后反转以彻底混合。在1000倍G下离心3分钟，使细胞产生颗粒。

拆下上一液。将细胞颗粒重新在一至两毫升的PDX处理介质中。将50至100微升之间的小等分转移到管中，并加入同等体积的分离酶溶液进行再分离。

评估聚类单元格悬浮液中的单元格编号。使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。根据制造商的说明重组透明质酸水凝胶解决方案。

使用多通道移液器，在双通道微流体板的观察窗口柱的所有孔中加入 50 微升 HBSS，以保持培养湿度和最佳成像条件。计算50微升水凝胶所需的细胞悬浮量，如每微升5000个细胞。对于播种一个微流体板，将计算的体积分成四个无菌的1.5毫升离心管。

使用前，立即使用 1 个正常的氢氧化钠将 HA 硫醇溶液的 pH 值调整为 8。通过将 40 微升 HA 硫醇与 10 微升 PEGdA 混合并随着时间的推移监测凝胶，执行测试凝胶。接下来，在200倍G和室温下将细胞悬浮液离心两分钟，以对细胞进行颗粒化。

小心地去除上流剂，将细胞重新用 40 微升的 HA 硫醇重新暂停，最终体积为 50 微升。在HA硫醇细胞的一个分项中加入10微升PEGdA。混合好，等待一到三分钟，然后播种微流体板。

将1.5微升的尖端粘贴到单通道重复移液器上，并在HA水凝胶溶液中用细胞进行加载。请记住保持氢气等分，确保细胞分布均匀。要播种微流体板，请将移液器尖端垂直于刀片，同时轻轻地将尖端置于凝胶入口的中心，以确保在分配 1.5 微升水凝胶溶液时接触无压力。

通过从板的顶部、板的底部或显微镜观察微流体通道的填充状态。使用此图作为指南评估负载。装货一分钟后，在准备下一个等分时反转板。

对HA溶液中剩余的三个细胞的分部重复微流体板的播种。填充所有芯片后，在37摄氏度的加湿培养箱中孵育板45分钟，直到凝胶完成。之后，使用提供的手册，确保灌注摇杆安装在细胞培养箱中，以 14 度角和 4 分钟间隔进行正确的灌注设置。

将 50 微升 PDX 细胞培养培养培养剂添加到所有培养中。轻轻敲击板对表面，以鼓励液体填充微流体通道。然后翻转板以检查通道是否正确填充。

为所有媒体添加 50 微升 DMEM/F-12。如果灌注通道中有任何气泡，请轻轻敲击板对表面，将其拆下。使用显微镜和板式布局形式，记录芯片灌装成功。

将未正确填充的芯片排除在进一步实验使用之外。将板放在倾斜摇杆上，设置为 14 度倾斜，循环 4 分钟，开始灌注。每两天更换一次PDX培养介质，先在入口中更换50微升，然后在插座中更换50微升。

在这项研究中，在标准水套细胞培养箱中安装了一个可编程灌注摇臂，并在标准生物安全柜中准备了双通道微流体叶片进行装载。3D微流体PDX培养机的生存能力和形态在未分离和密度梯度离心分离条件下均进行了评价。第一天，那些采用分离方法的培养物与未分离的培养物相比，单死细胞数量减少了十倍。

重要的是，分离的聚类主要由活细胞组成。未为群集大小分布确定统计显著差异。在微流体板块中进一步保持了7天的培养。

活细胞总数保持不变，聚类在培养的生命周期中保持了约80%的生存能力。请记住，每条PDX线都是独一无二的，因此肿瘤消化的易用性、聚类的表型大小和形态，以及聚类在梯度纯化中的位置会有所不同。使用此方法建立的 PDX 培养物可以通过基于图像或板读取器的生存能力分析、固定和免疫荧光标记或分离来收集细胞赖酸盐用于其他协议。

该方法将允许研究人员重述肿瘤微环境，以探索肿瘤细胞的生物学或药物反应。用户在使用人源组织之前，应完成标准的人体受试者培训和血液传播病原体培训。应佩戴适当的个人防护装备。