使用亲脂荧光染料的果蝇胚胎运动神经元的逆行追踪

本协议中描述的追踪技术有助于我们研究神经元形态发生，并捕捉果蝇运动神经元系统中的连接性。亲脂染料可以迅速扩散到细胞膜的每一部分，密度极高。这就是为什么我们的协议有效地解析，以找到一个标记神经元的结构。

如果使用注射微移子可以进入轴孔终端，则该技术可应用于苍蝇幼虫和成年阶段的神经元或其他生物体中的任何神经元。如果您没有解剖或使用微显微器对试样进行精确操作的经验，可能会具有挑战性。了解胚胎的解剖结构，将有助于指导正确部分工具进行解剖或结节。

首先，准备和布局所有胚胎收集材料。通过切断50毫升的管子，并在盖子上切开一个孔来准备过滤装置。然后设置一个网状过滤器，在管和盖之间有 100 微米的孔隙。

从同一毛细管中准备染料注射微管和解剖针，内径为 1.2 毫米。用微管拉管，从 170 伏最大输出 7%拉拔器，形成长约 0.4 厘米的尖针。要准备染料喷射微管，请用润湿剂浸泡研磨机，然后将针头放在 25 至 30 度的微移子夹上。

然后将尖端从斜面中心降到半径的三分之二。研磨针头，而注射器与管道推动空气进入它。用细尖永久标记标记微管，以指示斜角后开口的位置，因为定位以一定角度形成的狭窄开口可能具有挑战性。

允许苍蝇在室温下过夜产卵，早上用鸡蛋收集管子。要收集胚胎，用50%漂白剂将盘子上的卵子去氯5分钟。一旦氯离子清除，通过过滤装置或细胞过滤器倒入板内的东西，以分离胚胎。

使用挤压瓶水稀释盘子上留下的漂白剂，通过将混合物倒入过滤器中来收集尽可能多的胚胎。用水清洗胚胎三到四次，直到漂白气味消散。从设备中取下过滤器，然后用水将其洗到另一个干净的盘子上。

然后从胚胎上的新盘子中抽取水。使用精细钳子在产卵后 15 小时选择 5 到 10 个胚胎，并将它们放在双面胶带上，侧朝上。将昆虫环环盐水添加到解剖池中，以保护胚胎免受干燥。

在解剖显微镜下使用玻璃针将胚胎从胶带中膜中拖出玻璃，注意不要损坏胚胎的内部组织。然后切开单个胚胎的中线，从它的后端到前端。从中心翻转上皮组织，将表皮边缘连接到玻璃滑梯表面。

使用管连接针，尖端开口约 300 微米，以吸气或吹气，以去除后置纵向气管树干以及任何剩余的肠道。使用4%PFA和PBS在轨道摇床的室温下固定胚胎5分钟。然后用 PBS 洗三次。

用一微升的抗马萝卜过氧化物酶抗体与氰氨酸3染料和200微升PBS在轨道摇床上染色一小时。并在 PBS 中重复洗涤。要填充注射微管，请将注射微管放入毛细管支架中。

接下来，将染料幻灯片放在舞台上，并使用微操纵器将其定位在幻灯片上。然后调整舞台，将微管放在染料上。通过将喷射压力设置为 200 至 500 次，将喷射时间设置为 0.1 至 0.5 秒，将补偿压力设置为 5 分钟，收集微管中的染料。

收集染料后，取出染料幻灯片，将样品放在显微镜阶段。然后将补偿压力增加至 30 至 60 hectopascal 的范围，并降低微管进入样品。使用10倍的客观透镜定位胚胎，使微管与胚胎对齐。

将客观透镜更改为水浸镜头 40 倍。将镜头淹没到 PBS 中。使用荧光显微镜检查以抗HRP Cy3标记的神经元形态并确定注射部位。

当胚胎处于焦点时，改变微管的位置，与感兴趣的轴翁尖端进行温和接触。然后在注射过程中使用亮场显微镜查看染料液滴。将染料在 aCC 或 RP3 的神经肌肉交界处与 DID 或 DIO 一起将染料滴在右腹部半段。

使用手动控制释放染料并拆下微管。然后转到下一个注射部位。在成像前在轨道摇床上将样品在室温下孵育一小时。

使用精细钳子，从玻璃幻灯片上取下胶带。要安装样品，请准备在四个角落用少量真空润滑脂进行盖滑。小心地放在样品上，确保避免气泡。

向下推盖滑，以调整样品中的空间，以便允许客观透镜和幻灯片之间的工作距离。使用任务擦除去除任何多余的 PBS。用指甲油完全密封盖滑的边缘。

使用共体显微镜以 10 倍和 100 倍的放大倍率拍摄图像，并使用 imageJ 软件处理图像。该协议用于逆行标签的AC运动神经元内维肌肉1和RP3运动神经元内维肌肉6和7。来自 ACC 和 RP3 运动神经元的树突分支显示广泛的重叠。

两个神经元是双极的，建立两个不同的树突种群。为了演示这种方法的定量能力，在野生类型和Dscam1突变体中计算了树突尖的总数。aCC 的异构树突显示为野生类型，但很少观察到 Dscam1 突变体的异构树突。

尝试此过程时，重要的是要记住染料液滴的大小至关重要，约为 10 到 20 微米。测试双面胶带上的大小，然后将其应用于注射部位。利用这个程序，我们可以利用DID探头的光可切换性能获得等离子膜的超分辨率图像。

这样，我们可以研究神经肌肉结的突触膜的超结构表征。我们点击了。我们对突变菌株中的 aCC 树突进行了表型分析，发现 Dscam1-Dock-Pak 注射定义了 aCC 中树突的位点。