流循环模型中血液接触植入物的血液相容性测试模拟人类血流

该协议为根据国际标准组织指南的血液接触装置的血相容性调查提供了一个模型。该模型非常适合模拟与植入物对应的生理条件，因为血栓事件的低背景和低抗凝血剂的浓度使血液参数得到广泛分析。该方法是生物材料研究的理想的方法，因为它提供了一种评估血相容性的简单方法。

此外，它可用于临床前研究。对于肝素的装载，首先将5000个国际未稀释的肝素单位与0.9%的氯化钠混合，以获得每毫升肝素浓度15个国际单位。接下来，将稀释的肝素溶液的900微升添加到三个中性单体和三个保留的单体中，并将肝素加载的单体储存在4摄氏度。

血液样本采集前30分钟，将单体放在室温下。当单体加热后，在每个捐赠者将所有27毫升血液从捐赠者集中到一个塑料容器中之前，将9毫升血液收集到每个捐赠者的三个单体中。为了准备流环，用感兴趣的神经血管激光切割植入物每个条件至少加载一个管，并在每个管的一端放在充满0.9%氯化钠的储液罐中。

将卸载的管子放入储液罐中，将所有管子连接到泵头。然后将每个管的另一端插入测量油缸，并使用计时器将近位泵的设置调整为每分钟 150 毫升的流量，同时检查测量油缸中的填充水平。对于血容测试，使用12毫升注射器向每个管中填充6毫升血液。

形成电路后，使用 0.5 厘米长的硅胶连接管紧密地关闭管，将管子放在 37 摄氏度的水浴中。然后启动60分钟的管。对于全血计数分析，在灌注到含有EDTA的单个单体中后，从每个管中加入1.2毫升非灌注血液或1.2毫升血液。

小心地反转单体五次，将小瓶装入血液分析仪中，对每个样本进行血液计数分析。在分析结束时，将单体放在冰上 15-60 分钟。对于柠檬酸盐血浆的收集，用1.4毫升的未滴合或泛热血填满含有柠檬酸盐的单体，并小心地反转每个单体五次。

通过离心分离血浆，将血浆分数的三个 250 微升等分转移到单独的 1.5 毫升反应管中。然后将血浆样品冷冻在液氮中，并将其储存在零下20摄氏度，直到其分析。对于EDTA血浆采集，在血液计数测量后4摄氏度的孵育后，通过离心分离血浆，将血浆分数的三个250微升等分转移到单独的1.5毫升反应管中。

然后将血浆样品冷冻在液氮中，储存零下20摄氏度。对于 CTAD 血浆采集，用 2.7 毫升新鲜抽出或注入的血液填充含有 CTAD 的单体，并小心地反转管内五次。将单体放在冰上15-60分钟，然后通过离心收集等离子体。

将每个中间血浆分数的700微升转移到单独的1.5毫升反应管中，然后再次离心填充的反应管。然后将中间馏分的两个100微升等分转移到单独的1.5毫升反应管中，将液氮中的管冷冻在零下20摄氏度的温度下储存。为了测量柠檬酸盐等离子体样品中的TAT水平，在96孔平底板的每个孔中加入50微升ELISA样品缓冲液，将50微升的等离子体标准、等离子体控制和未稀释的等离子样品重复添加到该板的适当孔中。

密封板后，在37摄氏度下孵育样品15分钟，轻轻摇动。在孵育结束时，用每井300微升的洗涤溶液洗三次，然后向每孔添加100微升过氧化物酶结合的抗人TAT抗体。在37摄氏度的高温下孵育15分钟后，用每井300微升的新鲜洗涤溶液洗三次。

上次洗涤后，每井加入100微升新鲜准备的铬质溶液，在室温下孵育30分钟。在孵化结束时，向每个井添加 100 微升停止溶液，并使用标准曲线数据作为计算每个样品的 TAT 浓度的趋势线，读取 490 至 500 纳米光度计的光学密度。要准备用于扫描电子显微镜的植入物，请使用钳子将植入物从管子中取出，并在每次洗涤的新鲜 0.9% 氯化钠中短暂冲洗每个植入物三次。

上次洗涤后，将植入物存放在PBS中2%谷胱甘肽的单独容器中，在4摄氏度下过夜，不含有钙和镁。第二天早上，将植入物孵育到PBS的单个容器中10分钟，然后按指示将植入物在乙醇浓度上升中脱水10分钟。直接在血液采集和灌注后，白血球或红血球的数量或造血量值未检测到任何变化。

然而，在流量循环系统中灌注后检测到血红蛋白水平下降。血小板数也会减少，当管内存在未涂覆的支架时，血小板数量会增加。值得注意的是，当血液用纤维蛋白-肝素涂层支架孵育时，这种损失会减少。

TAT复合浓度因灌注而温和增加。但是，当添加裸机支架时，检测到 TAT 显著增加，表明凝固系统发生了深刻的激活。使用纤维素肝素涂层支架可防止此激活。

灌注导致增加的恭维级联的激活，不受未涂装或纤维蛋白-肝素涂层支架的存在的影响。同样，嗜中性粒细胞被激活，多态核嗜中性粒细胞酶水平的定量就证明了这一点。通过扫描电子显微镜进行可视化后，在灌注后，未涂覆支架表面存在密集的血细胞和蛋白质网络，而灌注后，在纤维蛋白-肝素涂层支架上未观察到。

最重要的是确认血液符合获取样本的含水标准，并尽快使用新鲜抽血。人类血液可能含有血液传播的病毒和其他病原体，并带有感染风险，因此在处理样品时一定要佩戴适当的 PPE。