该协议可用于筛选排列的扁病毒或逆转录病毒测定库，以确定癌细胞中转录因子的新调节器。该技术的主要优点是，它快速、中吞吐量和价格低廉，并且使用大多数调查人员通常都能接触到的设备和试剂。为了扩大和纯化库中的每一个扁病毒载体，首先在96井深井板的每个井中加入1.3毫升的Luria肉汤，每毫升安皮西林100微克。
每口井都接种两微升甘油，在37摄氏度和每分钟225转下进行夜间孵育。第二天，将每种细菌培养成单独的1.5毫升微离心管进行离心。根据制造商的说明，使用适当的细菌迷你试剂盒来净化每个病媒。
对于准备好的库中每个载体，用1倍10至第五个293FT细胞播种24井板的一个井，并在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞24小时。为了准备一个转染混合物，这将设置在库的每个载体，首先将每个扁病毒载体的最终浓度为50南克每微升与无核酸酶水。将每次稀释的五微升转移到 96 孔 PCR 板的单个孔中。
通过混合1.25微升倍x转染试剂一与23.75微升倍x预热转染缓冲液，进行转染超级混合。在室温下孵育转染超级混合物五分钟。然后添加 125 南图倍 x 的 psPAX2 和 125 南图倍 x 的 VSVG 到超级混合与温和的移液。
立即将超级混合物加入PCR条的每个管，并使用多通道移液器将混合物的25微升转移到稀释病毒载体的每个井中。在室温下孵育20分钟后，使用多通道移液器将每个转染混合物的30微升从每井转移到先前准备的24井板中相应的293FT细胞中。孵育细胞24小时，然后用500微升的新鲜完整生长培养培养本替换每井的培养，在细胞培养箱中再进行24小时孵化。
第二天，使用多通道移液器从每口井收集病毒上流剂，将每个上流水液的220微升收集到一个新的96孔板中的两口井中，生成一个排列的病毒上流液板。为了准备感染的 A375 细胞，在库中每个病毒载体的每井 0.5 毫升完整生长介质中，将 10 倍到第 5 个细胞的种子在 24 井板中。包括一个额外的井，不会感染，作为药物选择的控制。
在细胞培养箱中孵育24小时后，将冷冻排列的扁病毒中先型至上经温度解冻，然后用200微升生长介质将准备的细胞培养板的生长介质替换为200微升的生长培养基，并辅以每毫升多纤维素20微克。使用多通道移液器，将 200 微升病毒上流液从每 96 井转移到 24 井板的每个井中。将细胞返回细胞培养箱24至48小时。
在孵育结束时，用500微升的生长介质和紫霉素补充，将细胞返回细胞培养箱48小时。在选择48小时纯霉素后，将细胞分成三到四组，使单个组中的所有井的细胞密度相似，并将200微升的尝试辛-EDTA添加到每组一个代表性的井中，在37摄氏度下进行5分钟的孵育。一旦细胞分离，用400微升的生长介质中和尝试素，并计算每个三辛化井的细胞数量。
将每个细胞悬浮液稀释到每毫升浓度的2倍10至第5个细胞，生长培养基辅以紫霉素，从每个井中播种500微升细胞，进入新的24井板中的相同井位。使用每个代表性井的计数估计每个组中每个剩余井中的细胞数后，向每井添加适当的 trypsin-EDTA 体积，以实现每毫升浓度 10 倍到第六个细胞。在试液化过程中，使用多通道移液器将400微升生长介质加用紫霉素，加入到新24孔板的相应井中。
一旦细胞分离，轻轻混合每一个井的内容，并转移100微升每个细胞悬浮液到适当的相应的井在新的24井板。然后将细胞返回细胞培养箱24小时。要用双荧光酶处理器结构转染细胞，请准备转染稀释混合物，如表中所示。
要准备记者稀释混合物，混合每个试剂的体积乘以转染的总数加上几个额外的体积。接下来，将转染稀释混合物与记者稀释混合物混合，在室温下孵育所得溶液15分钟，产生转染混合物。在孵育过程中，用250微升PBS冲洗细胞培养板的每口井，并在每口井中加入447微升的新鲜完整生长介质。
然后使用多通道移液器将53微升的转染混合物分发到细胞培养板的每个井中。将板在37摄氏度和5%的二氧化碳24小时。为了测量荧光素酶活性，用去电化水稀释百西解酶活性试剂盒中的5X无源解液缓冲液，并解冻试剂盒中所需的试剂A和试剂B缓冲液。
当试剂准备就绪后，用75微升无源解液将每井中的上流液更换，并在室温下孵育板30分钟，偶尔摇晃。在孵育过程中，用解冻试剂B缓冲液将试剂盒B基板稀释至1至50浓度。在孵化结束时，在四口控制井中加入30微升无源解液缓冲液，并将30微升的解盐从每口井转移到96孔平底白化检测板的重复井中。
当所有莱酸盐都镀上时，使用多通道移液器向每个井中添加 50 微升试剂 A，并使用板读卡器读取萤火虫荧光素酶信号。然后使用多通道移液器将 50 微升试剂 B 添加到每个井中，并使用板读卡器读取 Renilla 荧光素酶信号。正如预期的那样，YAP2SA 增加萤火虫荧光酶活性，但与控制载体相比，不会增加雷尼拉荧光酶活性。
相比之下，YAP2SA S94A不会增加萤火虫荧光素酶活性。重要的是，YAP2SA不会改变缺少 MCAT TEAD 绑定元素的最小启动子结构的活动。在与 YAP-TAZ-TEAD 记者结构相染的细胞中，串联的 YAP 和 TAZ 短发夹显著降低萤火虫荧光素酶水平，但对短发夹的非靶向控制不然。
相比之下，在与最小处理器结构相染的细胞中，YAP-TAZ 短发夹RNA不会显著改变萤火虫荧光素酶水平。每个井中的 Renilla 信号也未因短发夹非靶向控制或 YAP-TAZ 短发夹 RNA 而显著改变。正如预期的那样，针对 YAP 和 TAZ、SARC 或 PI3 激酶的短发夹RNA显著减少 YAP-TAZ-TEAD 活性。
短发夹RNA针对ATM，CDH1，CSK，ERBB2和凝胶素每个增加正常化萤火虫荧光石酶水平与已发表的研究表明，这些蛋白质是雅普和/或TAZ。尽管 ATR、CCNE2 和 ERBB4 在其他细胞类型中已确立作用，但针对这些基因的短发夹 RNA 不会显著改变 A375 细胞中规范化萤火虫荧光素酶水平。在此屏幕之后，应使用其他读数验证识别稳压器的转录因子活性。
还应确认检测对已识别的稳压器的有效敲解。在使用传染性扁病毒时，请谨慎使用并遵循安全准则，尤其是在病毒具有人类传染性时。
