小鼠体内合成蛋白的定量测量

该协议允许CSF和血液采集在CSF蛋白质水平的定量校正中测量成神经紊乱的小鼠模型中的蛋白质合成。该程序提供了一个基线，据此可以评估感兴趣的CSF蛋白质的病理生理来源，以及血液CSF蛋白完整性的稳定性和功能意义。间间蛋白质合成和屏障完整性分析可应用于其他动物模型和人类研究。

例如，检查中枢神经系统的疾病。在小鼠中收集大量清洁CSF在技术上具有挑战性，因此建议在获得大量未污染样品之前练习该技术。演示这些程序的将是来自达特茅斯实验和分子医学课程的研究生Mymeal Linzey，我们新的免疫学研究小组。

用于通过逆行轨道出血收集血清。在确认超过15克麻醉小鼠对踏板反射缺乏反应后，用拇指和食指抓住耳朵后面的松弛皮肤，用无显性手的食指，并使用食指拉回眼睛上方的皮肤。用拇指将皮肤拉回眼睛下方，将巴斯德移液器的尖端（以大约 45 度角）放入眼球下方的眼窝中，朝向眼窝中间，同时在手指之间旋转移液器。

然后施加短暂、温和的压力并释放，让血液进入移液器。采集血液样本后，轻轻切除毛细管，不伤害眼睛，将血液转移到1.5毫升离心管。关闭眼睑后，用纱布施加轻度压力，以防止进一步出血。

让血液在室温下凝固30至60分钟，然后通过离心使样品旋转下来。使用清洁移液器技术，将分离的血清收集到标有 500 微升的新小瓶中，并立即将血清冷冻在 80 摄氏度。在确认对踏板反射缺乏反应后，去除足够大的头发区域，以便立即在麻醉小鼠头骨的骨端采集脑脊髓液。

在无菌条件下将鼠标放在立体技术装置的易发位置，用耳条稳定头部。用30%氯己丁二甲酸酯的手术部位，使下垂的皮肤切口低于奥奇普特，以暴露肌肉覆盖西斯特纳磁石。使用钳子，钝解剖皮下组织和肌肉，并使用微缩回器保持肌肉分开，以暴露杜拉母体脑膜层在西斯特纳磁石。

用无菌 PBS 轻轻清洗组织，以清除任何可能的血液污染，并使用无菌棉签将杜拉母体擦干。将初始穿刺定位在 cisterna 磁石中对于获得丰富的、未受污染的 CSF 至关重要。使用 30 量针，轻轻刺穿覆盖 cisterna 磁石的膜，并快速轻轻地将小玻璃毛细管插入穿刺中。

收集5至12微升的CSF时，小心地将管从膜上取下，并使用一块聚乙烯管将管子连接到三毫升注射器。将收集的CSF注射到冰上标有500微升的管中，并使用一次性针头和各种多二酮缝合线关闭切口。清洁任何干血或组织的区域，将鼠标放在干净、温暖的笼中，并进行监测，直到完全保持。

通过离心收集 CSF，目视检查颗粒并超浸其血液污染的任何迹象。然后使用清洁移液器技术，将含CSF的超盐转移到新的200微升管中，然后用PBS以一到三比稀释CSF，在80摄氏度时立即储存。对于通过心脏穿刺采集血清，在CSF采集后立即将鼠标放在超供位置。

用70%的酒精擦拭腹部皮肤。使用剪刀打开胸腔，露出心脏，并将连接到 3 毫升注射器的 25 针插入左心室。然后轻轻地对注射器柱塞施加负压，在采集血液后取走针头。

压压柱塞，将采集的血液喷射到1.5毫升小瓶中。现在，让血液在室温下凝固30至60分钟，然后通过离心分离血清。然后，使用清洁移液器技术，将血清转移到新的标签 500 微升小瓶中，在 80 摄氏度下立即储存。

要量化匹配血清和CSF样本中的目标蛋白质和白蛋白，请使用标准蛋白质定量测定，使用参考标准蛋白质为感兴趣的每种蛋白质准备标准曲线。分析后，将原始数据导出到相应的软件图形程序，并绘制检测信号荧光强度与标准蛋白质浓度，为感兴趣的每种蛋白质创建标准曲线。然后，使用标准曲线计算样本中每个感兴趣的分析物的浓度。

最后，使用白蛋白和目标分析物浓度计算Q值和内部指数。与相应的年龄匹配假对对相比，两个经测试多发性硬化症模型的CSF中，总IgG的实际水平显著增加。R-EAE小鼠表现出显著增强的白细胞商值，表明这些小鼠的血脑屏障的渗透性有所提高。

相反，TMEV-IDD和假老鼠之间在白细胞商之间没有差异，这证实了以前关于TMEV-IDD小鼠存在完整屏障的发现。此外，在TMEV-IDD动物中，IgG指数值显著上升，因此，观察到IGG内部生产。蛋白质指数的计算有助于识别对神经炎病和神经退行性疾病的早期诊断、结果预测和疾病过程监测有用的新型蛋白质生物标志物。