毛因神经发生期间诺奇信号动力学的实时生物发光成像

该方法有助于回答有关基因表达动力学在细胞增殖和分化中的重要性，特别是神经干细胞中诺奇信号分子动力学的关键问题。这项技术的主要优点是，我们可以通过活体成像以非常高的精度监测体外和体内的基因表达。演示这个程序的将是我实验室的助理教授HiromiShimojo，他开发了这项新技术。

对于Dll1 F荧光素记者介绍进入NPC，确认在胚胎日12.5至14.5怀孕小鼠的踏板反射缺乏反应，然后通过腹部，沿中线进行2至3厘米切口。将 PBS 浸泡的纱布放在切口周围，并使用环状钳子小心地提取右子宫角。数出胚胎后，使用微毛细管将一至两微升混合Dll1 F荧光石分析器DNA注入每个胚胎的心灵脑室。

成功的注射将导致在子宫表面遵守蓝色染料。对于电穿孔，用PBS将子宫和电极弄湿，轻轻抓住第一个胚胎的头部。将带正电荷的电极设置为注入DNA的半球一侧，并提供5个30至50伏、50毫秒的脉冲，脉冲之间暂停一秒，检查带负电荷的电极是否产生气泡。

当所有胚胎都注射后，将左子宫角返回到腹部，并使用17毫米的针头用4-0丝缝合线关闭切口，在完成闭合前将温暖的PBS放入腹腔。为了建立分离的NPC培养，首先将子宫从胚胎12.5天到14.5日怀孕的Dll1泛小通通荧光素转基因小鼠放入含有25毫升冰冷PBS的10厘米培养皿中，并使用微剪刀和细钳将胚胎从子宫中取出。斩首胚胎后，将头部放入含有冰冷 DMEM/F12 的新的 10 厘米培养皿中，并去除每个大脑周围的表皮和软骨。

在含有三毫升冷N2B27介质的解剖显微镜下将大脑转移到35毫米的培养皿中。从死头，从右和左电脑中去除。使用细钳去除覆盖电脑表面的脑毛，并从电脑中解剖皮层的侧侧部分。

当所有感兴趣的神经组织被分离后，使用 P1000 移液器将样品转移到单独的 1.5 毫升管中，并使用 P200 移液器从每个管中吸出任何额外的介质。每皮层添加100微升的木瓜溶液，并将样品在24摄氏度下放置15分钟。在孵化结束时，用新的P1000移液器轻轻移液样品10次，将管子返回24摄氏度，再增加15分钟。

在孵育结束时，再次轻轻移液样品，然后通过离心收集消化的组织。吸制超自然剂，用一毫升DMEM/F12介质轻轻重新暂停每个颗粒。将样品离心三次，每次离心后，用新鲜毫升的介质轻轻重新补充每个颗粒。

上次离心后，将N2B27介质的500微升颗粒重新加用1毫摩尔荧光素，将每个样品中的6个细胞种子种子到单独的聚L-Lysine涂层玻璃底盘上。然后，将板放在细胞培养培养箱中一小时。一旦细胞粘附在盘子上，在每盘中加入两毫升新鲜N2B27培养基加一毫升荧光素。

要可视化在NPC分离文化中的荧光酶记者表达，选择油浸物目标，将样品盘放在显微镜舞台上。手动查看该字段以确定查看单元格的最佳位置，并专注于感兴趣的单元格。单击"实时"获取测试图像，并使用多维采集程序通过二维发光和亮场采集运行延时采集 24 小时。

为了准备发展皮层切片培养，记者注射后一天，采集胚胎13.5至14.5胚胎大脑，将含有大脑的菜放在荧光立体显微镜的舞台上。确认每个皮层在适当的激发光下表达注射的荧光报告器，然后将大脑转移到一个硅橡胶切割板上，该切割板充满30毫升的DMEM/F12介质，气泡为100%氧气。使用微型手术刀和细钳切割后脑和横向部分之间的边界，将组织分离成两个半球。

然后，使用刀切割皮层像条纹，以获得皮质切片，转移切片在中等从切割板到一个新的35毫米培养皿，因为他们被获取。收集所有切片后，将每个切片的切割表面放在包含富集的玻璃底盘上，并相应地用细钳调整每个切片的方向。然后，用移液器去除多余的介质，将培养皿放入设置为 40% 氧气、5%二氧化碳和 37 摄氏度的多气体培养箱中，30 分钟。

在孵化结束时，在培养皿中加入300个富营养介质微升，并辅以一毫摩尔荧光素。要可视化切片培养物中的荧光酶处理器表达式，请选择 40 倍目标，然后将样品盘放在显微镜舞台上。获取荧光的测试图像，并在适当的激发光的照明下将位置和焦点平面设置为感兴趣的区域。

然后，通过三维发光、荧光和亮场采集运行延时采集 24 小时。为了监测振荡基因Dll1的启动者活动，可以使用泛素荧光酶，一个半寿命约10分钟的不稳定荧光素酶记者。像荧光报告器一样，荧光酶报告器可以通过与感兴趣的基因编码序列融合来监测蛋白质的表达动力学。

为了在组织培养中单细胞水平可视化记者表达，如所证明，记者基因可以通过子宫电穿孔短暂转染到NPC中。此外，基于显微镜的成像可实现对亮场、荧光和化学发光图像的采集。Dll1推广活动记者展示了NPC中源自Dll1泛化F百诗记者小鼠的电脑的振荡表达，不稳定的荧光酶记者表示启动者活动表达的上下剧烈调节。

在相邻的增强绿色荧光蛋白阳性细胞中，携带 Hes1 记者和 mCherry 阳性细胞表示 Dll1 蛋白质报告器在观察过程中彼此接触，Hes1 记者的表达似乎在接触后大约 60 分钟开始，表明相邻细胞之间传递 Notch 信号的时间延迟大约一个小时。此外，在信号传输过程中，Dll1蛋白质表达表现出动态转移。获得生物发光成像时，保持显微镜室完全暗，因为无关的光线可以防止最佳获得。

光遗传学的最新发展使我们能够用光来控制基因表达。通过该技术，我们可以同时引入各种基因表达模式，并监测荧光素酶报告器的反应。