使用波动测定测量微生物突变率

该协议允许在微生物中进行突变估计。它可以演示生物体环境环境环境如何影响自发突变的概率。该协议的主要优点是它便宜而高效。

许多突变率的估计可以并行进行。此协议措施的突变可能随抗生素的耐药性而发生。因此，此协议可用于研究世界上最大的挑战之一，抗微生物药物耐药性。

这种方法可以深入了解细胞生态环境如何影响抗微生物药物耐药性的进化。该协议估计了实验室菌株单一培养的突变率，但我们将其应用于临床菌株和两种菌株的共培养，以区分生物中分子。该协议中使用的最危险的反应是抗生素利福平和甲醇。

因此，当利福平溶解在甲醇中时，请务必使用防护手套和护目镜。开始这个程序接种三 mL 的液体糖原汤与从大肠杆菌 K12 甘油库存的冰刮。在 120 rpm 和 37 摄氏度下摇动 LB 培养，持续约 7 小时。

在此之后，用盐水溶液稀释培养2000倍。在每个管中加入10 mL的液体Davis最小介质，每个管中含有不同浓度的葡萄糖，如图所示。将稀释培养的100微升加入三个50 mL屏幕盖锥形底部聚合物管。

准备22 mL的五种不同的溶液的液体Davis最小介质与葡萄糖，每个在自己的50 mL管作为大纲在文本协议。为了为环境准备接种，首先测量600纳米的过夜培养物的光学密度。使用盐水溶液稀释培养物，并将 2200 到 110000 个细胞添加到每个环境中。

这将确保环境中一个 mL 的幼崽包含 1000 到 5000 个细胞。接下来，为 196 深井板创建并行培养的随机布局。根据布局将接种介质的一 mL 转移到板的每个井中。

然后，用胶带固定板盖，用盖子和胶带称重整个板。在 250 rpm 和 37 摄氏度下摇动板 24 小时。在此之后，在培养箱中放置两个L的蒸馏水，以稳定实验组之间的蒸发量。

通过将每个接种介质的 10 微升电镀在非选择性 TA 阿加板上，确定接种尺寸。使用无菌 L 形扩散器，直到加糖表面干燥。然后，在六个井板中准备含有利福平的选择性TA agar。

将选择性 TA agar 移入六个井板的每个孔中，将五 mL 移入。计算非选择性阿加盘上的菌落形成单位，并确定接种的大小。经过24小时的孵育，称重整个深井板，以确定蒸发量，这很可能约10%转移三个随机选择的培养物每个测定到标记的微离心管。

将剩余的81个平行培养物从深井板到含有利福平的选择性TA汞上。接下来，从选择性的阿加板上取下盖子，在无菌条件下将其揭开，以干燥阿加表面的所有液体。通过使用五个 10 倍稀释步骤稀释微离流管中的培养物，将 900 微升盐水溶液与每稀释步骤的培养物混合和涡旋，确定聚落形成单位的数量。

板 40 微升的最终稀释在非选择性 TA agar 上，并盖在板上。在37摄氏度下孵育过夜。一旦六孔板上的所有井都不含培养液，请重新盖上盖子。

然后在37摄氏度下用盖子孵育板44-48小时。第四天，计算非选择性阿加板上的菌落形成单位。第五天，计算选择性 TA 阿加盘上对抗生素具有抗药性的菌落数量。

记录特定测定的观测突变体数量在平行培养物之间的分布。打开计算机上的适当软件。在假设检验选项卡中，将值保留为默认值。

单击"浏览"并选择具有观察到的突变体分布的文本文件。上载文件后，单击已执行的测试。在右侧，根据测试结果，在一个样本 ML 测试下，找到突变编号。

这是m，预期突变事件的数量。然后，作为文本协议中的大纲，估计特定环境中特定基因型的突变率。此处显示了三种不同表型标记物的 MG1655 突变率，包括环素、利福平和纳利西酸。

在Davis最小介质中评估突变率，葡萄糖浓度为80毫克/升、125毫克/升和250毫克/升。在一种情况下，使用1000毫克/升的葡萄糖浓度。不出所料，环素耐药性突变率较高，纳利西酸耐药性最低，利福平耐药性率处于中间。

波动测定清楚地显示哪个菌株是构成突变，哪个菌株具有正常的突变率。由于突变性去酸菌株的突变率与纳利西酸的抗性比控制MG1655菌株高出约50倍。在准备此协议时，请确保您的细胞生长良好。

它们应该在具有相同环境的平行区域性之间以均匀的密度增长。这个过程的一个后续是确定抗药菌落中rpoB基因的DNA序列。确定变异的光谱对利福平耐药性如何随环境微生物基因型而变化。

20世纪的波动分析表明，突变是如何自发的和随机的，同时尊重环境。现在，他们正在揭示突变率在基因、生态、甚至社交方面如何随环境而变化的新发现。