从一个成年小鼠脑半球分离区域特异性微胶质，进行深度单细胞RNA测序

这种方法允许在单细胞水平上无偏地捕获微胶质基因表达，这可以帮助阐明健康而患病大脑中微胶质的分子异质性。该技术的主要优点是，它提供了从不同大脑区域快速分离微胶质的详细程序，并展示了如何有效地生成用于深度测序的单细胞RA6库的播放基础。要开始此过程，请准备文本协议中概述的所有需要的缓冲区和解决方案，并在冰上冷却它们。

安乐死和斩首鼠标后，用小剪刀切开头部的皮肤，露出下面的头骨。然后，切穿下垂缝合线、羊皮缝合线和冠状缝合线。使用钳子在不损害组织的情况下拉出双骨和异形骨的两侧，并小心地将大脑移入含有中等 A 的解剖培养皿中。

使用数字 55 钳子将小脑与皮质叶和脑干分离。然后，使用数字55钳仔细解剖出海马和线状体从皮层，并转移每个组织到一个单独的集合培养皿。首先，使用剃刀刀片将每个大脑区域切成小于一立方毫米的细片。

使用带尖端的一毫升移液器，将组织件转移到预冷却的 Dounce 均质器中。通过缓慢地将活塞旋转到 Dounce 均质器中，使组织均匀，进行 6 到 10 次全冲程，直到不存在可见的块。然后，通过70微米过滤器将分离的组织转移到50毫升管中。

用总共六毫升的冷介质 A 冲洗每个 Dounce 均质器和活塞，然后将冲洗转移到 15 毫升管中进行离心。在400倍g和4摄氏度下将单细胞悬浮液离心5分钟，5分钟休息。在磁性分离器中用三毫升 MCS 冲洗一个大损耗柱和三个大选择柱。

当组织样品的离心完成时，移液器取出并丢弃上流液，而不会干扰颗粒。在含有RNase抑制剂的MCS缓冲液中重新填充细胞。将100微升的米林去除珠添加到每个管中，每个管中含有从皮层和小脑中再悬浮的细胞，并在每个管中加入50微升的米林去除珠，每个管中含有从海马和色相体中再悬浮的细胞。

在冰上孵化管子10分钟。在此之后，将MCS添加到含有皮质细胞的管子中，使其体积达到两毫升，并加入剩余的管子，使每个体积达到一毫升。一旦柱为空的冲洗缓冲液，将两毫升皮质细胞加载到大损耗柱上，将彼此一毫升的细胞悬浮加载到单独的大选择柱上。

接下来，用一毫升的 MCS 缓冲液清洗大耗竭柱，每次洗涤时使用一毫升 MCS 缓冲液洗涤每个大选择柱两次。通过 35 微升滤机盖过滤细胞到圆底 FACS 管中。这些管子在400倍g和4摄氏度下离心5分钟，以产生细胞。

然后，慢慢倒出上根，在纸巾上涂抹管子的边缘。用 300 微升的 FACS 缓冲液重新填充每个管中的细胞。首先，在每个管中加入5微升小鼠FC受体块试剂。

在冰上孵育五分钟。然后，在每个管中添加一个 CD45 PE 尺寸 7 微升和 CD11B BV421 微升。在室温下将管子孵育在摇床上10分钟。

在此之后，添加两毫升的 FACS 缓冲液进行洗涤。在400倍g和4摄氏度下离心5分钟，以产生细胞的颗粒。用含有一微升的RNase抑制剂和0.5微升的碘化丙胺的FACS缓冲液，在每管中重新填充细胞。

按照标准的 FACS 程序，将带 100 微米喷嘴的单活微胶质分拣到 96 孔 PCR 板中，每个孔中包含四个微升的解液缓冲液。简要地旋转板，并使用台顶离心机旋转它们。将盘子存放在零下80摄氏度，直到库准备。

准备好继续操作时，在冰上解冻盘子。使用热循环器执行第一个转录，以生成cDNA，并放大cDNA与额外的外核素酶消化步骤，如文本协议中概述。之后，通过在每个井中加入18微升磁珠来净化cDNA。

在磁性支架上孵育板五分钟。然后，取出上一液，用新鲜制作的80%乙醇洗两次样品，每次洗净时用80微升乙醇。要进行标记，请使用纳米光移液机将每个 cDNA 样品的 0.4 微升与 1.2 微升 Tn5 标记试剂混合在 384 井板中，在 55 摄氏度下进行 10 分钟。

要停止标记反应，在室温下加入0.4微升中和缓冲液5分钟。接下来，在384个索引和1.2微升PCR混合到样本和放大库，如文本协议中概述。将同一 384 井板的所有独立库汇集在一起，并使用磁珠来净化最终的池库。

在这项研究中，微胶质从成年小鼠大脑半球的皮层、小脑、海马和线状体中分离。在显微镜下，使用锥蓝和血细胞计对准备好的细胞悬浮液进行检查，以估计在进行抗体染色之前清除米林的产率、细胞活力和功效。此时，皮层的总细胞计数应超过30，000，其他组织应超过5，000。

超过90%的细胞应该是可行的与小梅林碎片。FACS 机器用于对微胶质进行排序，微胶质通常是 CD45 低和 CD11B 正。成功分离应产生超过80%的微胶质出所有活的单细胞，至少对于皮质组织。

一旦单个微胶质被捕获到解解缓冲液中，RNA被释放，然后反向转录到cDNA，然后被放大23个周期。作为毛细管电泳平台，碎片分析仪和高灵敏度NGS片段套件提供有关尺寸分布的快速、准确信息，以及96井板每个井中存在的cDNA分子数量。显示500到5000个碱基对之间的污迹样本，以及高于一定浓度阈值的样本可用于制作库。

这些样本被测序到每个细胞超过一百万的原始读取深度，从而饱和了单细胞RNA测序方法的检测能力。每个微胶质细胞的映射率约为60%，超过2000个基因。以前从这种分离方法生成的数据通过独立实验复制，证明了在序列种群中检测微胶质特异性基因的敏感性。

通过单微胶质转录的信息，研究人员可以在他们感兴趣的环境中发现独特的细胞群，并进一步研究这些新识别的细胞群的功能相关性。