测量自噬和前列腺通量中的日节律

我们的协议允许测量小鼠组织中自噬和蛋白酶活性的速率，并且足够灵敏，可以检测这些活动中的昼夜变化。该技术可用于体内评估细胞和组织中的蛋白质代谢，所需的材料相对较低，可供任何分子生物学实验室使用。演示这个程序的将是米哈伊尔·雷日科夫，一个来自我实验室的博士后。

在每个时间点前十五分钟，将利普蛋白和波特佐米布库存溶液加热至室温，并稀释无菌 PBS 中解冻的 bortezomib，以产生每毫升 50 毫克的工作溶液。对于蛋白酶抑制剂给药，内向每千克利普蛋白注射40毫克或每公斤1.6微克每克的玻色素。对于负对照，给小鼠注射0.5毫升PBS。

将每只小鼠返回到按注射时接受的治疗类型分组的笼子，并记录小鼠在标准化表中接受治疗或操作的时间。注射两小时后，将从每个牺牲的实验动物中采集的左肝叶淹没在7毫升的冰冷均质缓冲液中，在冰上适当标记15毫升锥形管中。获得所有样品后，将第一个样品和整个均质缓冲液体积转移到 15 毫升容量的 Dounce 均质器中，并用 10 个松散活塞冲程和 15 个紧活塞冲程使样品均质化。

将由此产生的粗质均质返回到其原始管中，并像刚刚证明的一样使下一个样品均质化。当所有样品均质化后，通过离心沉淀同质核和碎屑，将每个后核上更远分的四毫升转移到新的15毫升管中。根据标准协议确定第一个上清液分数的蛋白质浓度，并必要时用新鲜均质缓冲液将所有样品的浓度均衡到每毫升2.1毫克。

为进行下游分析和质量改进，将500微升的正态总蛋白质馏分放入1.5毫升微离心管中，用于零下80摄氏度的储存。将每一个剩余总蛋白质分数的1.5毫升转移到单独的微离心管中，通过离心对蛋白质样品进行颗粒化。将产生的第二分数超盐的一毫升转移到冰上新的微离心管中，并吸气剩余的超自然。

每次洗涤时，将 3K 颗粒在 1.5 毫升新鲜冷均质缓冲液中洗涤两次，然后在 200 微升 SDS-PAGE 样品缓冲液中重新将 3K 颗粒重新暂停，并在 95 摄氏度下将样品煮沸 5 分钟。在20，000 x g和4摄氏度下旋转第二部分超自然剂20分钟，将由此产生的第三个细胞质部分超自然物转移到一个新的微离心管中。对于 SDS-PAGE 分析，将 150 微升的细胞质分数与 50 微升的 4x SDS-PAGE 样品缓冲液混合，在 95 摄氏度下将细胞质分数样本煮沸 5 分钟。

从 20K 颗粒中吸出剩余的上清液，每次洗涤用 1.5 毫升新鲜冷均质缓冲液洗涤样品两次。然后在 100 微升 SDS-PAGE 样品缓冲液中重新填充 20K 颗粒，在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟。对于西方印迹分析，连续稀释标准曲线蛋白一至三成 1x 样品缓冲液，共稀释 6 个样品，并加载每个标准曲线样品的 10 微升到 26 井中的一个井中 4 至 12%SDS-PAGE midi 凝胶，然后加载预装商业分子量标准。

要测量自噬通量，将每个 3K 颗粒样品的 12 微升装入相应的孔中。为了测量蛋白酶通量，将每个细胞质分数的12微升加载到适当的井中。当所有控制和实验样品都加载后，通过SDS-PAGE分离蛋白质样本，然后根据标准协议将蛋白质转移到聚乙烯氟化物膜上。

用于分析巨体通量，在四摄氏度下，在四摄氏度下，含有具有抗p62或抗LcB抗体的3K颗粒样品的印迹膜。用于分析蛋白酶通量，含有细胞质分数样本的印版膜，具有抗莱辛48特异性多泛素抗体，在4摄氏度过夜。然后使用标准的二次抗体和成像设备对西方印迹进行成像。

要对标准曲线和实验样本的感兴趣波段执行密度测量，请打开适当的图像分析软件程序，并绘制一个长矩形，包括延伸至膜顶部的印迹图像底部的蛋白质单体。复制并粘贴以将矩形移动到其余样本，使矩形在样本之间保持一致。将量化保存到电子表格中，并使用线性或多项式回归中的序列稀释标准样本在电子表格中生成密度测量标准曲线，以获得最佳拟合标准曲线方程。

使用此方程，推断实验样本中感兴趣的单体的数量。为了获得通量测量，请从同一时间点的PBS样品的平均值中减去每个抑制剂处理样品的外推蛋白质量。然后使用双向 ANOVA 评估蛋白质周转时变化的统计显著性。

在任何给定时间点，自噬通量的主要读出是所处理的利普汀与富含 3K 颗粒分数的假样本之间巨细胞特异性标记量的差异除以 2。通常，结果被规范化为均值，从而简化了独立实验之间的比较。我们测量蛋白解通量的程序取决于利普蛋白或波特佐米布导致自噬和蛋白酶基质的积累的能力，这是一个时间依赖的过程。

这项技术允许探索生物节律如何编程肝蛋白代谢。我们希望这将为调查疾病对细胞内务功能的影响铺平道路。