使用一套实用可行的方法,描述英国皇家空军家族激酶与疾病相关的突变体

这种方法有助于有效描述与疾病相关的RAF激酶方法。该技术高度敏感且可重复性，经济高效，用户友好，无需任何先进设备。为了测量RAF突变体的催化活性，在根据标准协议将整个序列插入适当的载体之前，通过PCR将标志技术突变引入RAF编码序列。

将谷胱甘肽插入到RAF突变编码序列上游的转移酶编码序列，以同样的方式生成编码谷胱甘肽为转移酶融合RAF突变体的载体。根据标准协议，Transvect 80%至 90% 汇合 293T 细胞培养与向量编码标志标记 RAF 激酶或其突变体。经过24小时的培养，更换每种文化中的媒介。

培养48小时后，在冰上每一个井中加入400微升的解液缓冲液，并辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂。5 至 10 分钟后，将细胞乳酸转移到 1.5 毫升管中，用于离心沉淀细胞碎屑。将每个样品的300微升转移到单独的1.5毫升微离心管中。

每个样品留出40微升用于下游批发莱酸盐化石外细胞信号调节激酶一和二表达和活动氨基印迹分析。在每个管中加入20微升的抗旗亲和力珠，在4摄氏度的冷室中旋转一小时。在孵育结束时，快速轻轻清洗抗旗珠，在冷室用解液缓冲液轻轻清洗一次，用激酶反应缓冲液轻轻清洗一次，然后加入20微升激酶反应混合物。

具有低Dima亲和力的图形突变体可能会因为Dima分离而失去体外催化活性。因此，快速和温和的洗涤是至关重要的。在室温下10分钟后每隔一分钟翻转一次，用5个XSDS样品缓冲液的5微升停止激酶反应，每个样品在90摄氏度下煮沸样品5分钟。

在孵化结束时，使用0.1%SDS在9至12%聚丙烯酰胺电泳凝胶上运行样品，然后将蛋白质转移到硝基纤维素膜上，以便通过免疫印迹检测每个样品中磷质三粒细胞活性蛋白激酶和RAF突变体的水平。要评估激酶死亡皇家空军突变体的蛋白质组活性，构建编码RAF接收器或激酶死RAF活化剂的载体。Transvect 293 T 细胞具有两个载体编码 RAF 接收器和激酶死 RAF 活化剂， 或单个向量编码的蛋白质之一， 如证明.

如所示，在培养48小时后收获整个细胞的乳酸，并在室温下将干净的全细胞乳酸与5个XSDS样品缓冲液快速混合，在90摄氏度下将乳酸盐煮沸5分钟。然后运行煮沸的整细胞解酶样品在9至12%聚丙烯酰胺电泳凝胶为0.1%SDS和转移蛋白质到硝基纤维素膜检测磷外细胞信号调节激酶一和二的水平，并控制蛋白质通过免疫印迹，如证明。测量RAF突变体的相对暗淡亲和力和或稳定性，构建编码旗技术草案突变体的载体，融合到萤火虫荧光酶的端子或萤火虫荧光酶的C术语。

Transvect 293 T 细胞与一对载体编码不同和术语的萤火虫荧光酶 RAF 突变体和 C 头科一个萤火虫荧光酶 RAF 突变体如证明。24小时后转盘两次10至第五293T细胞事务每井成水晶黑色图像板在无色介质。转液后48小时将荧光素加入293T细胞转维，孵育30分钟。

在测量多检测系统上的荧光素酶信号之前。在测量结束时，对超吸量进行吸气，并用 lysas 缓冲液对 293 个 T 细胞进行飞毛水，如所证明的。使用 0.1% SDS 在 9 至 12% 聚丙烯酰胺电泳凝胶上运行整个细胞解质样品。

检测萤火虫荧光酶RAF突变体的结束终点的表达水平，或萤火虫荧光酶RAF突变体的C终点通过反旗氨基印迹的表达水平，如所证明的。然后根据萤火虫荧光酶末和萤火虫荧光酶RAF突变体结束终点的表达水平，使293个T细胞转越子的荧光酶信号正常化。体外激酶 asa 可用于有效探测一些有组织活性的 R-spine 突变体，但不包括具有融合 C-spine 的激酶死亡突变体。

然而，具有弱二暗亲和力或稳定性的组成活性RAF突变体的催化活性，可能无法通过使用这种 ASA 来探测，因为其二氧化二暗体在纯化过程中被打破。为了避免RAF突变体失去催化活性，具有弱的二丁体亲和力或稳定性，这些突变体可以与谷胱甘肽转移酶融合，以挽救突变体的催化活性。皇家空军共同激活 ASA 可用于评估激酶死亡 RAF 突变体的同性活性。

如图示激酶死突变体与酸性端端质图案和C脊柱融合，功能作为同酸性活化剂触发突变体与非磷相对酸性终端图案的催化活性，当共同表达在293T细胞。此外，免费分裂荧光素酶SA可用于测量RAF家族激酶及其突变体的相对暗淡亲和力或稳定性。使用低浓度洗涤剂的 lysas 缓冲液，并在样品纯化过程中快速温和的洗涤程序对于成功的体外激酶 SA 至关重要。这项技术将帮助研究人员准确确定疾病如何传递RAF突变体，激活下游途径，促进疾病治疗的适当治疗策略的选择。