环境细颗粒物小鼠组织中三种 DNA 损伤的质谱定量及水平评价

这里介绍的方法允许对氧化应激引起的DNA病变进行定量，有助于理解病理生理机制，这些机制可能是预防和治疗疾病的目标。选择性和灵敏度是主要优势。选择性是处理复杂生物样品时的基本优势。

HPLC 与串联质谱法相结合，演变为此类生物基质定量的黄金标准。氧化应激是不同病理生理过程的一个常见事件。在炎症性疾病患者的组织或尿液中检测到乙三分泌水平增加。

DNA病变还提供有关接触污染物引发的内源性事件的信息。例如，如果DNA病变增加，暴露可能达到增加癌症发展风险的水平。病变可以从任何细胞系统的DNA中量化，也可以在尿液、血浆、唾液培养基中进行量化，并适应样本制备。

首先，使用放在冰上的培养板作为底座，用手术刀切割一块组织。每个 50 毫升封顶管中称一克组织，供立即使用。将剩余组织放在干冰上，然后储存在零下80摄氏度。

在每个管上，加入10毫升含有0.5毫升二恶高金的商业细胞解解溶液，并留在冰上。将组织均质器设置为低速，大约 60 到 90 rpm。使冰上组织均质几分钟，直到溶液没有组织碎片。

然后，在每个均质样品中加入150微升蛋白酶K溶液。通过反转摇动管子，并在室温下过夜。早晨，加入40微升核糖酶A溶液，通过反转摇动，并将管子保持室温两小时。

加入5毫升商业蛋白沉淀溶液，大力旋转，在2000倍g，4摄氏度的离心机，持续10分钟。将超钠转移到含有 10 毫升冷异丙醇的 50 毫升封顶管中。轻轻反转管子几次，直到观察沉淀的DNA。

使用末端关闭的巴斯德移液器收集沉淀的 DNA。将收集的DNA转移到含有四毫升10毫升三叶草缓冲液和pH7分之一毫升二恶八千胺的管子中溶解。DNA完全溶解在管子中后，将含有4%异丙醇的氯仿溶液加入四毫升。

倒置管10次进行均质化，在2000次g，4摄氏度的离心机，10分钟，并转移上相到新的管。使用氯仿溶液重复上相的洗涤两次。然后，加入8毫升绝对乙醇和0.4毫升的五摩尔氯化钠溶液，沉淀DNA。

再次，收集沉淀的DNA，并转移到三毫升的70%乙醇。用70%乙醇重复洗涤一次。请小心丢弃乙醇溶液，并反转吸收纸上含有沉淀DNA的管子，以去除多余的溶液。

在根据手稿制备具有15N5同位素标准的DNA水解样品后，将HPLC-UV对正常脱氧核苷酸进行定量化。将剩余体积进行固相提取。要执行 HPLC，请首先将 C18 列连接到 C18 安全卫士墨盒上，其梯度为 0.1% 甲酸和甲醇。

设置梯度程序，从零到25分钟，甲醇为零至18%，从25到27分钟，用18至0%甲醇运行，然后从27分钟运行到37分钟，以每分钟1毫升和30摄氏度的流量运行0%甲醇。之后，为保留用于正常脱氧核苷酸定量的每个样品注射2至6微升的体积。将 DAD 探测器设置为 260 纳米，用于整合脱氧瓜诺辛和脱氧二甲苯二辛峰。

要对分析 1、N6-乙苯甲酸酯和 1、N2-乙氧-脱氧瓜诺辛进行固相提取，首先在一千升的体积下用一系列溶液加载墨盒。加入100%甲醇、去维水、水解DNA样品、去维水、10%甲醇、15%甲醇，最后100%甲醇进行收集。然后，按照手稿进行。

在制备了8-牛-脱氧瓜诺辛的DNA水解样品15N5同位素标准后，将每个样品的80微升转移到小瓶中，在HPLC-ESI-MS/MS系统中进行分析。保留剩余的 20 微升，用于在 HPLC-UV 上定量除氧瓜诺辛，如前所述。为了分析HPLC-ESI-MS/MS上的8-氧化脱氧瓜诺辛，将C18列 A耦合到具有溶剂 A 和 B 梯度的 C18 安全卫士墨盒中，流速为每分钟 150 微升，温度为 25 摄氏度。

在25分钟内用溶剂B的零至15%运行二元泵，25至28分钟用溶剂B运行15至80%，28至31分钟用80%的溶剂B运行，31至33分钟用80%至0%的溶剂B运行，33至46分钟用80%至0%的溶剂B运行。溶剂B的80%至0%在33至46分钟之间。引导 A 列前 16 分钟浪费。条件列B由等电位泵与溶液15%甲醇在水中含有0.1%甲酸，流量为每分钟150微升。

6 分钟后，检查色谱，确保从 A 柱到 32 分钟间隔内从 A 列分离出 8-oxo-脱氧瓜诺辛标准阀，将阀门切换到允许 A 柱和 B 柱之间连接的位置。在 32 分钟内关闭阀，从第二列中分离出 8-oxo-脱氧瓜诺辛，并获得一个锐利的色谱峰值。为了分析 1、N6-乙氧乙酯和 1、N2-etheno-脱氧瓜诺辛，将一个 C18 柱耦合到具有溶剂 A 和 B 梯度的 C18 安全卫士盒中，流速为每分钟 130 微升，温度为 25 摄氏度。使用 0% 的溶剂 B 运行二进制泵前 10 分钟， 10至39分钟为溶剂B的零至20%，溶剂B的20至75%为39至41分钟，75%的溶剂B为41至46分钟，75至0%的溶剂B为46至47分钟，47至60分钟为溶剂B的0%。47至60分钟为溶剂B。

使用开关阀将前 35 分钟的 Eluent 废物和 35 到 42 分钟的分数引导到 ESI 源。确保指定标准在设定的间隔内从列中分出。集成8-牛-脱氧瓜诺辛15N5同位素标准的8-牛-脱氧瓜诺辛的峰值， 1、N6-乙氧乙酸酯、15N5同位素标准1、N6-乙三-脱氧二甲酸、1、N2-乙氧二氧氨酸、15N5同位素标准1、N2-乙氧二氧氨酸（HPLC-ESI-MS/MS）分析。

计算校准曲线和样本的面积比率。建立校准曲线，并计算每个注射样本的病变量。从 HPLC-UV 分析中集成脱氧瓜诺辛和脱氧二甲苯丙氨酸的峰值。

使用区域建立校准曲线，并计算每个注射样本中动物中的脱氧瓜诺辛和脱氧二甲苯二氨酸的量。计算8-牛-脱氧瓜诺辛对脱氧瓜诺辛，1，N6-乙氧-脱氧二甲氨酸在脱氧二氧氨酸，和1，N2-乙氧-脱氧瓜诺辛超过脱氧瓜诺辛，这提供病变数每百万正常脱氧瓜诺辛或脱氧二氧二氧诺辛。HPLC-UV 获得的纯化 DNA 的代表性色谱图显示存在四种正常脱氧核苷，不含RNA核糖苷，表明 DNA 纯度。

显示了来自HPLC-ESI-MS/MS的代表性色谱图，包括8-氧化-脱氧瓜诺辛、1、N6-乙氧-脱氧-脱氧二氧合成素和小鼠组织DNA样本中的1、N2-etheno-脱氧瓜诺辛。通过紫外线检测获得的色谱图显示，从第一列到约10分钟，4个正常的脱氧核苷酸从8-牛-脱氧冠氨酸良好分离，消除了不必要的干扰。对于精确定量，要记住的一个重要事情是，在校准曲线和样品中，注射量中始终具有相同的内部标准。

此处介绍的方法可适用于其他改性脱氧核苷酸的定量。扩大改性脱氧核苷酸的带子，可以更好地了解潜在的病理生理机制。我们可以研究氧化损伤在不同情况下的作用，如接触异种生物、糖尿病和细胞恶性转化，从而帮助制定预防和治疗策略。