该协议支持病毒感染的可视化，并提供对感染环境及其周围细胞环境的时空分辨率的深入见解。免疫污染的适用性不仅允许检测病毒，而且实际上也允许使用各自的细胞标记区分各种细胞亚组。将组织固定为免疫污点，将大脑样本在PBS中以4%的半成甲醛的1比10的比例放置，在4摄氏度下对组织体积进行至少48小时的采样。
在固定期结束时，每次洗涤在 PBS 中洗三次组织样品至少 30 分钟，然后将样品在 4 摄氏度时将 PBS 中的 02%亚兹化钠转移到。然后使用振动器设置为 0.3 至 0.5 毫米/秒刀片进给速率，将组织分成 1 毫米厚的部分。将部分储存在PBS中，温度为4摄氏度。
对于甲醇预处理将样品浸入上升的甲醇系列中，在室温下，每孵育一小时，轻轻振荡。最后一次孵育后，将样品冷却至摄氏四度。用四毫升预冷漂白溶液代替 100%甲醇，在摄氏四度下进行过夜孵化。
第二天早上，用四毫升新鲜80%甲醇代替漂白溶液，在室温下孵育一小时。然后将样品浸入一系列降下降的甲醇中，与刚才演示的相反，在 20%甲醇浸入后，将样品在 4 毫升 PBS 中洗涤一小时。对于脑组织部分的免疫吸收，在PBS中洗涤样品两次，用4毫升0.2%Triton X-100洗涤样品，随后在4毫升37摄氏度的渗透，在0.2%Triton X-100、20%二甲基硫化物和0.3万酸二苯醚中渗透两天。
在37摄氏度下，在PBS中用4毫升0.2%Triton X-100、10%二甲基硫化物和6%的正常血清阻断任何非特异性结合，为期两天。在阻断孵育标签结束时，样品用两毫升原抗体溶液在37摄氏度下5天，在2天和1~2天后刷新抗体溶液。接下来，在PBS中每毫升肝素的4毫升0.2%Tween 20和10微克中清洗样品一天，在一天中至少更换4至5次洗涤缓冲液，并在一夜之间留下最后一次洗涤。
第二天，在2毫升二次抗体溶液中孵育样品，在37摄氏度下孵育5天。然后用四毫升的新鲜 0.2% Tween 20 和 10 微克每毫升肝素在 PBS 中清洗样品，如证明。用于样品的核染色，将样品孵育为核酸染色的四毫升 TO-PRO-3 中，保护样品五小时免受光。
在孵育结束时，在PBS中每毫升肝素中洗涤样品0.2%Tween 20和10微克，随后在上升的tert-丁醇系列中脱水两小时。90%浸入后，将样品一夜之间转移到96%的三甲醇溶液中。第二天早上，将样品进一步脱水在100%t-butanol中两个小时，然后清除新鲜准备的BABB-D15中的组织部分两到六个小时，直到它们具有光学透明。
然后，样品可以存储在 BABB-D15 中，防止光线，直到其安装和成像。对于样品安装，请使用 3D 打印机打印成像室和盖子。使用单组分室温硫化硅橡胶将直径 30 毫米的盖玻片安装到成像室上。
同样，在盖子上安装 22 毫米盖玻片。使用水湿棉签去除两个环上的多余的硅橡胶，然后让橡胶通宵固化。第二天，在成像室中放置样品，在插入盖子之前，将一小体积的BABB-D15添加到成像室中。
使用皮下针将腔内用 BABB-D15 填充腔室，并在用硅橡胶密封成像室之前将入口插入。要设置图像采集，请选择用于荧光灯的适当激光线，并调整每个探测器的检测范围，以防止信道之间的信号重叠。然后设置采集参数以查找 Z 堆栈的上边框和下边框并获取图像堆栈。
要生成图像堆栈的 3D 投影，请打开斐济的图像文件，然后选择"图像颜色通道工具更多"和"分割通道"，将合并的图像拆分为各个通道。对于图像的漂白校正，对于每个通道，请选择"图像调整漂白校正"和"简单比率"。使用滑块调整每个通道的亮度和对比度，然后选择"图像颜色"和"合并通道"。
勾选"创建合成"选项。将图像转换为 RGB 格式，并选择"图像堆栈"和"3D 项目"以生成 3D 投影。选择最亮点作为"投影"方法，并设置切片间距以匹配获取的图像堆栈的 Z 步进大小。
为了达到最高质量，将旋转角度增量设置为 1 并启用插值。根据需要修改"总旋转"、透明度阈值和不透明度。然后将 3D 投影另存为 tiff 和 AVI 文件格式。
利用狂犬病病毒磷蛋白复合层的受感染神经元细胞的免疫感染，可以在小鼠脑组织样本的厚部分中可视化。随后，可以重建采集图像堆栈的无缝 3D 投影。由于获得图像堆栈的高分辨率，感染可以评估到单个细胞级别，从而允许断言，例如，有关在感兴趣的细胞中抗原的丰度和分布。
除了小鼠脑组织外，该协议还可以应用于其他动物物种的脑组织样本。例如，从受感染的雪铁龙大脑的不同隔间获得的部分显示不同程度的狂犬病病毒感染。星细胞可以通过胶质纤维酸蛋白的表达进行分化，而中性可以专门染色用于微管相关蛋白II. 同时，病毒蛋白可以共同染色，以评估受感染细胞与高光细胞亚群之间的关系。
对于免疫保持抗体的选择，以检测感兴趣的蛋白质是至关重要的。虽然标准免疫体化学浓度通常是一个很好的起点，但一些抗体可能需要额外的调整。本协议中使用的许多化学品具有有害特性。
穿着适当的个人防护装备（包括实验室外套和手套）在烟罩中进行相应的实验。
