从正式固定组织检测利沙病毒抗原的免疫化学测试

用于免疫造血和诊断组织病理学的组织通常固定在10%磷酸盐缓冲剂中。在固定在甲醛中的脑组织中检测狂犬病病毒抗原提出了独特的挑战，IHC检测已被证明是狂犬病病毒抗原检测的一种敏感而具体的方法。活检或其他检测方法的主要优点是可以检测出与组织和细胞形态相关的抗原。

通过 IHC，大脑和非脑组织中狂犬病抗原的本地化提供了无法通过常规血氧林和 Eosin 染色部分获得的其他信息。狂犬病诊断测试对于在接触狂犬病病毒的人类中开始接触后预防非常重要。IHC 是对正式固定组织最常见的检测之一。

与特定的抗体，它可以用于检测各自的病原体。要开始此程序，将三到五毫米的脑组织片，在尸检后收集，放入10%缓冲的甲醛溶液中24至72小时。记录大致的组织重量、组织类型和形式素的体积。

将组织放入 70% 乙醇中，以便在正式固定后和加工前将组织储存更长时间。标本固定后，解剖组织以包括重要的大脑区域，如脑系统、小脑或海马的横截面。每个，削减到三到五毫米厚度。

将纸巾放入处理盒式磁带中。处理石蜡渗透的组织盒。把它们嵌入石蜡块中，并把它们切成微原子。

首先设置文本协议图 1 中概述的染色盘。每道菜都装满250毫升的预制溶液。要准备 AEC 基板库存溶液，请使用玻璃移液器将 AEC 的一片 20 毫克的片剂溶解在 5 毫升 N、N-二甲基甲酰胺中。

要准备蛋白酶库存溶液，请将 7 毫克蛋白酶溶解在 200 毫升 PBS 中。要准备冲洗缓冲器，添加 100 毫升 Tween 80 至 990 毫升 PBS，并混合好，形成 PBT-T 的同质溶液。使用微原子，制作一个五微米的石蜡部分。

将水浴部分加载在摄氏38度的水浴上，并将其收集到玻璃滑梯上。用耐试剂笔标记幻灯片。将滑梯放在托盘上，在 55 到 60 摄氏度的烤箱中熔化一小时。

然后，从烤箱中取出幻灯片，并立即将其脱光，每次使用 3 次连续 5 分钟的二甲苯冲洗。在此之后，按照文本协议中所述，通过连续浸入中将乙醇稀释到去离子水中，对幻灯片上的部分进行补水。用蛋白酶处理滑梯30分钟进行蛋白酶抗原检索，然后用PBS-T冲洗滑梯10分钟，用3%过氧化氢处理10分钟。

在此之后，再次用 PBS-T 清洗幻灯片 10 分钟。首先，从缓冲器中取出一个滑梯，确保一次只处理一个滑动，而其他滑动仍被淹没，并用纸巾从组织部分周围擦去多余的缓冲器。将滑梯放入湿度室，在室温下用普通山羊血清孵育15分钟。

接下来，在室温下用最佳的预定稀释原发性抗狂犬病抗体和负控制抗体在湿度室中孵化滑梯60分钟，中间不洗。在此之后，用 PBS-T 清洗滑梯 10 分钟，并在室温下用生物色素抗体在湿度室中孵育 15 分钟。再次用 PBS-T 清洗幻灯片 10 分钟。

在室温下用条状隔板和 HRB 复合物孵育滑梯和湿度室 15 分钟，并清洗 PBS-T 10 分钟。然后，在室温下与 AEC 在湿度室中孵育 10 分钟。在去离子水中清洗滑梯10分钟，与吉尔的血氧化物对冲，用去离子水稀释一到二，两分钟。

在此之后，通过将滑梯浸入去离子水中冲洗，冲洗多余的血氧林。在斯科特的自来水中冲洗滑梯 30 秒，在电离水中洗 10 分钟。一次取下一个滑梯，并安装它们与水溶性安装介质。

然后，使用光显微镜读取幻灯片。在这项研究中，一种免疫细胞化学测试被证明用于检测狂犬病病毒抗原，作为正式固定组织的替代诊断测试。这里显示了不同脑组织中正负对照样本的代表性免疫细胞化学染色结果，包括脑系统、小脑细胞和纯金细胞以及海马。

品红色染色，通过使用AEC基板对蓝色反染色背景表示颜色发展，是由于抗体对狂犬病抗原的反应。免疫造血术的阳性结果与组织部分的品红色染色相对应。细胞质内含物和不同尺寸的颗粒内含物的染色表明样本对RABV感染呈阳性反应。

样本被视为阴性，如果没有特定的红色染色或只有蓝色背景，由于血氧林，被观察到。除了阳性染色外，内含物的分布还可以间接量化样本中狂犬病抗原的水平，这可能与组织样本的病毒载量相对应。无论分布水平如何，任何特定的污渍都会将样品分类为 RABV 抗原检测阳性。

组织应充分固定在正式素中，并避免在此过程中冻结组织。狂犬病抗原由IHC检测到，然后分子技术可以在石蜡部分进行，根据RNA序列信息确定莱莎病毒变异。像二甲苯和甲醛这样的试剂应该用烟气罩处理。

在处理 AEC 时应小心谨慎，因为它是致癌物质。