一种用于蛋白质溶解活性的荧光肽裂解检测: 冠状病毒穗蛋白活化的应用

这种方法可以帮助回答生物化学领域的关键问题，如蛋白质的蛋白质解法修饰，以及抑制剂和蛋白酶和肽的表征。这项技术的主要优点是，它允许快速筛选肽上的蛋白酶蛋白酶活性，代表给定蛋白质的裂解侧。这里的用途是研究激活病毒融合的蛋白酶。

肽设计的第一步是从公共数据库（如NCBI或病毒病原体数据库）获取感兴趣的融合蛋白序列。选择蛋白酶识别站点进行聚变肽，包括该序列的上游和下游两到三个氨基酸。订购肽时，使用荧光共振能量转移或 FRET 对、末终点的 Mca 和 c 终点的 Dnp 修改它。

在测定过程中，Mca 非常兴奋，并发出光能，只要两者彼此靠近，就会被 Dnp 淬火。但是，如果发生裂解，Dnp 将无法淬火，荧光板读取器可以读取这些排放。根据厂家的建议，通过轻轻上下移液，重新暂停肽。

例如，在70%乙醇中重新被重新暂停，最终浓度为1毫摩尔。如果肽不通过移液很好地重新暂停，将含有肽和溶剂的管放在声波浴中，直到完全重新暂停。将肽的100微升等分分分配到光阻尼或耐药管中，以保护肽免受漂白。

将等分储存在零下 20 摄氏度。首先打开板读卡器并等待自检完成。接下来，打开所连接计算机上的操作软件，并确保它与板读卡器连接。

打开温度设置，将其设置为所需的温度，以获得最佳性能的蛋白酶，这是 30 摄氏度，在这种情况下。要设置实验，请单击控制仪器设置，选择动力学，然后选择荧光。输入 330 纳米的激发波长和 390 纳米的发射波长。

取消选择自动截止并选择中等/正常灵敏度。为检测选择一小时的运行时间，每 60 秒选择一次测量。在第一次测量前设置五秒钟的混合时间，在每次测量前设置 3 秒的混合时间。

最后，选择要读取的井。如文本协议所述，为蛋白酶准备适当的测定缓冲液，并在冰上冷却缓冲液。将一个纯黑色聚苯乙烯未处理的平底96孔板放在冰上，下面有一个薄金属板，以支持冷却和稳定性。

必须使用黑板作为检测板，以防止邻近油井的荧光泄漏。每肽，每个检测准备三个技术复制，每个样本的总体积为100微升。将适当数量的测定缓冲液放入检测板的每个井中。

在每个井中加入0.5微升蛋白酶。到六孔，添加0.5微升缓冲液，而不是各自的蛋白酶。其中三个将是盲目的对控制，另外三个将是肽对等控制。

除了盲控外，将五微升肽加入到每井50微摩尔的最终浓度中。在三个盲控井中，每口都加入五微升缓冲液，而不是肽。将板插入荧光板读卡器，然后单击"启动"。

在开始数据分析之前，请保存实验文件。单击导出，然后将文件导出为 txt。将 txt 文件导入电子表格。

首先创建一个图形，根据每个样本每个技术复制的 x 轴上的时间绘制 y 轴上的相对荧光单位。选择图形在线性范围内的数据范围，以及最接近荧光开始增加的数据范围。在第二个图形上绘制所选数据并添加线性趋势线。

在趋势线选项中，选择图表上的显示方程。方程将显示 V 最大值，对应于趋势线的斜率。从三个技术复制中计算每个样本的平均 V 最大值。

再重复两次实验后，为了获得三个生物复制，根据三个独立的生物复制的数据计算标准偏差。人类MERS冠状病毒、EMC/2012 S2原位，以及骆驼衍生的双突变菌株HKU205，以及EMC/2012的单突变变种，显示EMC/2012肽被有效切割，而HU205的S2原肽几乎没有分裂发生。EMC/2012 A-S 变异 S2 原肽的裂解被强烈减少，并且几乎没有 EMC/2012 S 到 I 变异 S2 原肽的裂解。

另一项毛茸茸裂解测定显示，与人类 MERS 冠状病毒 EMC/2012 S2 主要位点相比，骆驼衍生的摩洛哥 213 S2 主要基点仅出现最小的裂解。在原型S1/S2肽、FECV I和4 S1/S2中观察到富林裂解，但在变异的S1/S2肽FIPV I黑色S1/S2中未观察到。同样，毛皮能够切割原型S2原肽，FECV II 1683 S2素，但不是变异的S2原肽，FECV I和4S2素，FIPV I黑色S2素，和FIPV II 1146 S2素。

按照这个程序，西方的印迹分析或氨基荧光测定，使用感兴趣的全长蛋白质进行验证蛋白裂解，或者在这种情况下，如果裂解导致病毒融合蛋白的致生版本。