低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

这种方法有助于回答蛋白质相互作用领域的关键问题，使细胞外蛋白质的检测具有新的结合性，既具有高通量，又具有高灵敏度。这种方法的主要优点是，只需几微克的蛋白质，就可以使用微阵列打印机生成数百张幻灯片。使用标准微型阵列进行幻灯片打印。

该仪器的容量为每次运行 57 张幻灯片，使用包含 48 个斑点引脚的打印头，每张幻灯片最多可容纳 8，000 个点。使用 384 个井板生成工作板，每孔从库存板中收集 10 微升样品。在使用微阵列进行幻灯片打印之前手动执行此步骤。

然后在60%湿度下将带毛刺型斑点针的蛋白质发现到环氧硅烷上滑动，以防止蛋白质斑点脱水。Cy3标记牛血清白蛋白可以在每个蛋白质样本之间重复发现，以可视化掩码拟合阵列。打印后，从加湿环境中取出蛋白质微阵列幻灯片。

接下来，使用超声波雾器生成沉淀到滑动表面的阻塞溶液的细雾。然后，用 PBST 中的 5% 牛奶在一夜之间阻塞幻灯片，以对表面进行测量。将幻灯片存放在零下 20 摄氏度的 50%甘油中，以防止结冰。

细胞外蛋白之间的相互作用通常以低亲和力为特征。为了能够检测这些相互作用，通过增加结合的狂热性，我们开发了一种基于捕获查询蛋白的多价方法，这些蛋白表示为蛋白质 A 涂层微珠上的 FC 标记细胞外域。旋转带的载波IgG，该载波已标有Cy5单一反应染料，如文本协议中所述。

要计算查询蛋白和Cy5 IgG的摩尔比，将查询蛋白的分子量除以IgG的分子量，乘以每毫升40微克，以确定所需的Cy5 IgG的浓度。一旦确定所有比率形成微珠蛋白复合物，结合FC标记查询和Cy5 IgG与蛋白质 A 微珠。在室温下将 PBS 中的悬架混合在管旋转器上 30 分钟，防止光线。

要开始筛选，请先在室温下加热准备好的幻灯片，然后再装载到杂交站。要执行筛选，请先用 PBST 清洗微阵列一分钟，以去除残留的甘油。在PBS 5%牛奶中加载200微升1毫克每毫升蛋白质 A，孵育30分钟，以防止未合成的蛋白质微珠与微阵列中可能存在的FC标记蛋白结合。

杂交站用PBST清洗幻灯片后，加载200微升的查询微珠复合物，每毫升蛋白质 A 含量为1毫克，孵育30分钟。杂交站对滑梯进行杂交和清洗后，用水冲洗滑梯，并将它们放在单独的 50 毫升锥形管中。在 900 次 G 下旋转 5 分钟，将管材干燥。

最后，使用适合检测 Cy3 和 Cy5 荧光的微型阵列扫描仪扫描幻灯片，分别以 532 和 635 纳米的速度检测 Cy3 和 Cy5 荧光。此处显示的是打印幻灯片的代表性图像。Cy3 标记的牛血清白蛋白斑为绿色。

这些斑点是重复打印的，作为印刷过程的质量控制。此处显示了一种孤立的蛋白质的代表性结果，该结果经过筛选，用于识别使用细胞外蛋白微阵列技术进行结合伙伴的识别。重复的红色斑点被识别为筛选查询蛋白的命中。

这种方法是高度通用的，可用于打印各种蛋白质库，他们特定的蛋白质系列或蛋白质的大型汇编，如我们的。任何感兴趣的蛋白质都可以被评估。在尝试此过程时，必须小心处理幻灯片，并确保它们不会干涸，以防止打印的蛋白质的活动损失。

在感兴趣的蛋白质的屏幕之后，强烈建议进一步验证使用正交技术（如表面质感共振）观察到的任何命中。这项技术在开发之后，为研究人员研究细胞外蛋白质在人类中的相互作用铺平了道路。