基于荧光素酶的大抑癌 (拉图) 生物传感器监测河马信号通路活动

我的实验室一直在研究河马通路在乳腺癌和肺癌中的作用，最近，我们开发了一种新的生物传感器来监测河马信号活动。此方法可用于回答有关蜂窝信令网络的关键问题，例如 Hippo 通路如何响应因子，以及它如何与其他信令通路交互。与现有方法相比，该技术的主要优点在于其灵敏度高，而且样品数量也大量可快速、同时处理。

该技术在基础和转化研究中具有多种应用，用于研究河马信号通路在体外和体内的调节器。首先，迷你准备LATS-BS质粒新鲜从DH5-阿尔法细菌液体培养。转染前一小时，从板中吸出介质，并在每井中加入500微升生长介质。

一个重要的一点是，LATS生物传感器必须准备新鲜，以获得最大的表达和活动。此外，建议在进行荧光素酶测定时始终使用河马通路道的上游调节器（如 MSD）作为正对控制。在此之后，将细胞返回到培养箱。

接下来，准备溶液 A、DNA 溶液和溶液 B，如文本协议中描述的稀释聚合物转染试剂。在此之后，立即将溶液 B 添加到解决方案 A 中，并轻轻地上下移液器进行混合。在室温下孵育样品15分钟，使转染复合物形成。

然后，用柔和的旋转将转染复合物的总体积滴到板的每个井中。在37摄氏度下孵育细胞过夜。第二天，移除含有转染复合的介质，代之以全新介质。

然后在37摄氏度下培养细胞一天。用蒸馏水稀释适当量的5倍无源解液缓冲液。然后，从板中完全吸气介质。

在每个井中加入一毫升 PBS，轻轻旋转板以去除分离的细胞和残留的生长介质。然后完全吸气 PBS。接下来，向每井添加 250 微升 1xPLB。

将培养板放在摇杆上 15 分钟，以确保使用 PLB 均匀覆盖电池单层。在此之后，将利沙酸盐转移到1.5毫升微离心管中。从 80 摄氏度的存储中去除 LAR-2，并将其与室温平衡。

然后，为适当数量的检测准备雷尼拉检测试剂。将Renilla检测试剂加入50x基板及其缓冲液。接下来，将每个细胞的10微升水切成1.5毫升管。

然后，对一个发光计进行编程，以执行两秒钟的预测量延迟，然后是 10 秒的测量周期。小心地将 20 微升 LAR-2 试剂转移到一个管中，然后快速上下移液器混合。然后，立即将管放在发光计中并启动读数。

读取后，从发光仪上取出样品管，加入 20 微升的 Renilla 试剂，上下移液器混合。然后，将样品放在亮度计中，然后开始下一个读数。首先，培养、分离、计数和板 HEK293 广告单元，如文本协议中所述。

然后，在转染前一小时，从板中吸出介质，然后用五毫升的新鲜完整生长介质代替。最后，将稀释溶液B添加到溶液 A 中，并上下移液器混合。然后，在室温下孵育样品15分钟，然后将转染复合物的总体积添加到板中，同时轻轻旋转。

在37摄氏度下孵育细胞过夜。第二天，对细胞进行三分位化并计数。板1万至2万个细胞进入每一个96井板的井，每井的介质总体积为100微升。

在此之后，孵育细胞一天。在进行荧光素酶测定前一到四个小时，添加可能调节河马通路剂的剂剂，最终浓度为每井10微摩尔。接下来，从细胞中完全吸出介质，用 100 微升 PBS 清洗每个井中的细胞。

然后，在每井中加入20微升的PLB。将文化板放在摇杆上 15 分钟。然后，将 20 微升 LAR-2 试剂转移到板的每个井中，并上下移液器进行混合。

在此之后，立即将板放入板读数发光计中并启动读数。在该协议的第一部分，LATS-BS与不同的基因共同移植，以评估它们对LATS激酶活性的影响。在第二个协议中，LATS-BS被转染到 HEK293-Ad 中，细胞被传递到 96 孔板中。

转染40小时后，用河马信号的不同已知小分子调节器对细胞进行治疗，然后进行荧光素酶测定。在解释这些测定的结果时，应该注意，蛋白质和药物治疗可能会激活影响生物传感器活性的反馈途径。需要进一步的实验，以确认候选人和河马信号通路之间的关系。

按照此过程，其他方法（如定量实时 PCR 或西 Blot）可用于回答有关 LATS 激酶活性的其他问题。该技术开发后，为癌症生物学领域的研究人员在许多生物和生化过程中探索LATS激酶和河马信号通路的动态和活性铺平了道路。不要忘记，用于筛查的药物可能极其危险，在执行此程序时应始终采取适当的预防措施。