Autometallography 在鲸目组织中的定位和半定量银的应用

该方法有助于回答环境毒理学领域有关亚器官分布和生物系统内重金属浓度的关键问题。该技术的主要优点是，AMG是一种易于使用且价格低廉的方法，是研究组织中重金属的宝贵佐剂。我们使用海豚和鲸鱼的组织来演示协议。

然而，我们相信该协议可用于各种动物物种。与李文塔一起演示手术的将是我们研究所的临床医生顺 Theng 。首先从搁浅鲸目动物中收集配对的肝脏和肾脏组织进行AMG分析，并在10倍于10%中性缓冲形式素体积的10倍的情况下固定组织，24至48小时。

接下来，使用一次性不锈钢微切刀片将固定原成的肝脏和肾脏组织修剪成两厘米，由一厘米、三毫米部分，将同一个体的肝脏和肾脏部分放入同一贴标盒中。通过一系列分级乙醇和二甲苯浸入，然后浸入一小时和两个小时的石蜡浸渍，使组织处理器中的部分脱水。经过两个小时的石蜡浸泡后，将组织转移到钢组织学模具的底部，并将脱水组织样本与新鲜融化的石蜡嵌入。

冷却冷板上的固定、石蜡嵌入的组织块，直到石蜡凝固，并在微原子上修剪每个块，直到组织表面暴露。在零下20摄氏度下冷却样品10分钟，并在微原子上获得5微米组织部分。使用钳子和刷子，在获得组织部分时抬起组织部分的丝带，并将它们漂浮在 45 摄氏度的双蒸馏水浴表面，直到它们可以分离，并放在单独的显微镜幻灯片上。

然后，将幻灯片放在幻灯片加热器上一小时，温度为 60 摄氏度。然后，将幻灯片放在幻灯片架中，将部分去石蜡化，在三个不同的染色盘中，含有 200 至 250 毫升纯非二甲苯，进行 8 到 5 分钟和 3 分钟的孵化。水合物在分级乙醇溶液的不同染色盘中去除样品，随后在双蒸馏水中冲洗。

在 PBS 中冲洗部分一次，辅以 5%Triton X 100，仅 PBS 中多次，在新鲜双蒸馏水中冲洗一次，每次洗涤 30 秒。上次洗涤后，用300微升的混合银增强试剂盒溶液给每个样品贴上标签，在室温下在黑暗中不超过15分钟。在孵化结束时，用双蒸馏水清洗滑梯，并在每张幻灯片的300微升赤氧树脂中对部分进行反染色，10秒钟。

用自来水清洗滑梯。干燥它们，并安装与安装介质的部分。然后，在光学显微镜的40倍目标下，捕获每个组织部分的10个随机组织学图像。

要分析自动金属学或 AMG 样本的积极性，请在相应的图像分析软件程序中打开图像，并选择图像、类型和 RGB 堆栈，将第一个图像拆分为红色、蓝色和绿色颜色通道。在蓝色通道中，选择图像、调整和阈值，以测量每个图像中具有 AMG 阳性信号的区域的百分比，根据核或红血球中存在假阳性区域，手动调整每个图像阈值的截止值。单击分析并设置测量值，并检查面积分数，以指定记录区域分数。

单击"分析"和"测量"以显示结果窗口的每个组织学图像百分比区域列的正百分比区域。要评估电感耦合等离子体质谱的结果与AMG阳性值之间的相关性，请打开相应的图形软件。创建新的项目文件，然后选择 XY 和关联。

输入电感耦合等离子体质谱和AMG分析的结果，并选择分析，并结合，分析Pearson相关分析结果之间的关联强度。在参数、非线性回归窗口中，在拟合页上选择不同的回归模型，并在比较页上选择比较方法。包括额外的平方 F 测试和 Akaike 的信息标准。

根据比较方法的结果，在鲸目动物组织学银测定中选择一个相对合适的回归模型，并利用测定法估计鲸目动物肝肾组织的银浓度，银浓度未知。AMG阳性信号包括肝细胞和库普弗细胞细胞质中大小可变的棕色到黑色颗粒，以及一些近体肾管的流明和地下室膜中偶尔无定形的金黄色到棕色AMG阳性信号。根据额外的平方F测试和Akaike的信息标准，在分析的肝脏和肾脏组织中，电感耦合等离子质谱的结果和AMG阳性值与通过原点的首选线性回归有正相关。

在尝试此过程时，重要的是要记住，AMG 方法是一种辅助方法，必须与其他特定方法（如 ICPMS）一起使用，以监测组织中重金属的实际成分。