Name: investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans at JoVE.com

We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1.监控跨细胞扩散的朊病 ​​毒样蛋白在体内时间推移成像注:成长C.线虫野生型（WT）（N 2）和转基因品系根据标准方法，并仔细控制培养温度47。 <ol><li> C.产生的转基因株系线虫表达朊状蛋白质，具有标记的单体红色荧光蛋白（MRFP）。观看此视频，演示了如何使用微量注射48。对于进一步的细节和方法，描述如何将这些外的线路整合，见49。 </li><li>通过根据标准方法50产蛋或漂白准备同步种群。 <ol><li>通过同步产卵<ol><li>转让10 - 20妊娠成年人放在盘子里，让他们产卵1 - 2小时。从板除去成虫，并让后代生长，直到所需的年龄。 </li></ol></li> &lt;LI&gt;同步漂白<ol><li>收集妊娠成人的非同步的人口和与碱性次氯酸盐溶液（250毫NaOH和1:4（V / V）稀释的市售漂白剂的H 2 O）漂白它们。与M9的缓冲区47（21 MMNA 2 HPO 4·两次（218 XG 1分钟）将鸡蛋洗净后7H 2 O，22 mMKH 2 PO 4，86 mMNaCl，1 mMMgSO 4·7H 2 O，加起来的dh 2 O〜1升）。 </li><li>允许它们在M9缓冲孵化温和搅拌O / N在20℃。蠕虫发展将阻止在所述L1阶段在没有食物来源的，留下一个同步的人口。转移到L1S新鲜线虫生长介质（NGM）接种OP50 E.板杆菌细菌并让子代发展，直到所希望的47岁。 </li></ol></li></ol></li><li>在显微镜载玻片上制备2％的琼脂糖垫（在H 2 O）如所述50。 <ol><li>准备两英里croscope幻灯片与标签带放置在其整个长度将用作间隔物​​。把他们之间的第三显微镜载玻片。 </li><li>溶解2％琼脂糖在H 2 O和吸管一滴到干净的幻灯片。 </li><li>将第四幻灯片垂直于琼脂滴顶部的其他三个幻灯片。轻轻按下变平垫以相同厚度作为标记带。 </li><li>让除去间隔物，轻轻拉动滑动分开之前，干燥1分钟。琼脂板将继续坚持其中之一。 </li></ol></li><li>吸管〜10微升麻醉（2毫左旋咪唑在M9缓冲液中）到垫和转让〜使用铂丝挑10只动物。盖上盖玻片（〜22×22毫米），在1小时内拍摄图像。 </li><li>或者，为了获得电影在一段较长的时间，或以进一步降低对动物的任何移动的可能性，使用麻醉剂和珠固定51的组合。 <ol><li>准备10％AGA玫瑰区（在M9缓冲区）所描述的51，并添加蠕虫3微升纳米球的大小标准溶液（聚苯乙烯珠，100纳米），加上3微升麻醉剂（4毫米左旋咪唑M9缓冲）。以盖玻片覆盖平缓。为了避免干燥，密封盖玻片与VALAP（等量的凡士林，羊毛脂和石蜡的混合物）。 </li></ol></li><li>利用共聚焦显微镜图像固定蠕虫。 注意:测试结果是使用一个转盘的AF共聚焦显微镜配备有EM-CCD照相机和显微镜自动化及图像分析软件如的MetaMorph获得和轮廓的细节在下面，但其他类似的共焦成像系统也可以使用。 <ol><li>使用63X或100X / 1.4NA油浸物镜，并将包含蠕虫到显微镜载玻片架​​显微镜载玻片。 </li><li>打开软件。调整激光功率和过滤器MRFP成像。用10％的功率和排放过滤器&gt; 600纳米561纳米的激光。 </li><l我&gt;打开"多维收购"。在"主"选项卡，勾选框"慢速拍摄"和"运行日志"（硬件自动对焦:关闭）。 </li><li>在"保存"选项卡上选择或创建所在的文件保存的目录文件夹。指定一个名称的文件。 </li><li>在"波浪长度"选项卡中选择合适的照明和调整曝光和增益。用"YokoQuad红"（或等同的照明设置为MRFP成像）与100和300毫秒之间，100和300的照相机增益之间的曝光，这取决于个体的样品（使用实时图像评估）。 </li><li>在"时光倒流"选项卡中选择"时间点数量"= 301，"持续时间"= 5分钟，"时间/间隔"= 1秒。 </li><li>在"日志"选项卡中选择杂志:"AFC集合Z HOLD"和"AFC返回到Z HOLD"，类型:＃8220;特别"（两次），初始点:"时间起点"和"结束时间点"。此自动聚焦选项是很重要的图像相同的部分在一段较长的时间。 </li><li>当安装完成后，点击"获取"。在慢速拍摄视频萨法德作为独立的TIFF文件。 </li><li>打开一个给定的时间序列的ImageJ所有.tiff文件。转到"图像"→"栈"→"图像至栈"。或者，调整亮度和对比度，加上大小酒吧等出口"文件"下的电影→"另存为"→"AVI ..."（对于一个例子，看视频1和2对应的图1）。 </li></ol></li></ol> 2.采用折叠式传感器和应力记者调查细胞自主和非细胞自治影响的Proteostasis和毒性<ol><li>产生共表达折叠传感器或压力reporte转基因株系R 3与朊病毒蛋白样蛋白在一起。关于如何建立十字架或产生转基因株系方法见48,49,52。 见表1 C.名单线虫菌株可以使用。 </li><li>准备转基因动物的种群同步成长，直到上述（1.2节）50所描述所需的年龄。 </li><li>利用体视显微镜，检查折叠传感器或压力记者各自的表型。 <ol><li>对于折页传感器，确定动物在同步之后窝藏在每一天的聚集体的数目（对于一个例子，参见图2E和F）。 </li><li>为应力记者，如果测试的朊病 ​​毒样蛋白导致报告的增加的荧光的共表达（对于一个例子，参见图3）。 </li></ol></li></ol> 3.全基因组屏幕为抑制在C.朊病毒引起的毒性线虫<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> 图所述RNAi筛选方案4.示意图。参见协议部3的各个步骤的详细描述。 <ol><li> C.同步线虫蠕虫和RNAi文库的重复<ol><li>对于RNAi筛选，使用Ahringer的RNAi库（或比达尔的RNAi库）53,54。填充用100μl的LB-amp培养基补充有10％甘油的板（50微克/毫升氨苄青霉素的LB）Rearray所述RNAi文库从原来384孔格式到96孔板，并接种使用96针复制器。生长在37℃CO / N在搅拌并储存在-80℃。 </li><li>维持C.线虫 WT和在20℃下对NGM板的转基因株系接种有大肠杆菌 OP50根据标准方法47 杆菌细菌。 </li><li>通过漂白朊病毒域转基因和WT（控制）线虫同步（见1.2）。 </li><li>就在同一天，该蠕虫被漂白，准备补充50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基。使用自动试剂分配器分配（或吸管手动）65微升的LB-amp培养基中于96孔板的每个孔中。 </li><li>从-80℃取出96 Ahringer的RNAi库板，将他们无菌罩内衬用纸巾。立即端着盘子倒挂，而板块仍然冻结，小心，以避免对板的外冰污染取出密封胶带。 Reinvert板，并让它们解冻约30分钟。 </li><li>浸1无菌96针复制到一个RNA干扰库板，然后到一个新鲜的LB-Amp平板。选用一个新鲜无菌复制每个板块。所有封板的粘合铝箔胶带，并返回库板至-80℃。该复制器可浸泡在漂白，清洗，并高压灭菌，以再次使用。 </li><li>允许重复的RNAi板成长O / N在孵化器设置为37℃和300转。使用HT115 E.杆菌细菌携带空载体（L4440）作为对照，分别生长在一个培养管中，然后吸取65微升用多道移液器培养成四分之一2 96孔板的。 </li></ol></li><li>感应细菌的dsRNA产生和附加蠕虫的<ol><li>稀释异丙基β-D- thiogalactopyranosid（IPTG）至5mM的浓度在双蒸2 O.使用自动化工作站与多通道头分配（或吸管手动）10微升稀释的IPTG到的RNAi的细菌和对照板的每个孔中。重新密封，并放置在板放回孵化器。让他们在37℃摇动3小时。 </li><li>虽然细菌正在动摇，准备蠕虫。混合在M9 /蠕虫悬浮良好，并吸取少量样品（〜5 - 10微升）到玻璃显微镜载片上。算蠕虫在立体显微镜下的数量，并计算每微升的蠕虫数目。 </li><li>使用无菌技术，制备补充的M9（M9 +）的溶液具有以下的最终浓度:0.20毫克/毫升的IPTG，8.0微克/毫升胆固醇，50微克/毫升氨苄青霉素，9.6微克/毫升四环素，0.0835微克/毫升两性霉素B，和每50微升15蠕虫。 <ol><li>使朊病毒域转基因和WT蠕虫单独的解决方案。的需要将依赖于复制（见下文）的RNAi板的数量的M9 +蠕虫溶液的最终体积，加〜30毫升死体积，将留在储，如果一个自动化分配器使用的。 </li></ol></li><li>在3小时的诱导细菌的dsRNA生产后，将板从孵化器，并让它们冷却至室温（约30分钟），以避免热应激反应。 </li><li>分配50μl的M9 +朊病毒域的转基因线虫的解决了RNAi的板的每个孔中，并在空载体对照板之一。使一定要混合各步骤之前蜗杆溶液作为动物倾向于沉淀到容器的底部。 </li><li>分配的WT蠕虫入第二控制板。离开启封，以允许通气板。以防止蒸发的液体培养基，堆栈4 - 5板块一起，敷用湿纸巾和铝箔。孵育以200rpm在20℃下4天。 </li></ol></li><li>进球 注意:之后在孵化4天，所述蠕虫将会在成年期的第二天，并准备屏幕。让这些动物筛选，以确保无干扰抖动之前调整到非振荡的条件进行30分钟。 <ol><li>使用猎鹰4M60相机连接到计算机的监视器，屏幕目视增加抖动，与对照处理的朊病毒域的转基因动物进行比较。 </li><li>编制初步命中名单，以确认使用wrMTrck（见下节）。 </li></ol></li></ol> 4.确认初步的屏幕点击<ol><li>固体板活力测定<ol><li>制备板的NGM补充有100微克/毫升氨苄青霉素，12.5微克/毫升四环素和1mM IPTG，按照标准方法47。如果可能的话，使用的板浇注机，以确保所有的板块有媒体相同的高度，这将允许一个更精简的视频采集过程。 </li><li>生长的不同的RNAi克隆中约1毫升LB培养基+50μg/ ml的氨苄青霉素，O / N在37℃和250转。 </li><li>第二天，诱导dsRNA的表达用1mM IPTG 3小时。种子用150微升每RNAi的细菌克隆，摊成薄层板。让干燥为在黑暗2天在RT的细菌。准备每RNAi技术克隆3板。 </li><li>通过按照标准方法50（参见1.2节）漂白，蠕虫人口同步，让卵孵化O / N在M9媒体。 </li><li>取蜗杆悬浮的样品，并确定NEM的量每微升atodes在体视显微镜。然后，吸管的M9加上蠕虫的正常体积到各试验板，以使其包含25 - 30 L1的蠕虫。成长的线虫在20℃4天，直到蠕虫达到成年的2天。 </li></ol></li><li>虫蠕动的wrMTrck插件ImageJ的定量分析 注:使用立体显微镜，在放大10倍与滨松的Orca-R2数码相机C10600-10B和滨松简单PCI图像处理软件的视频记录。 <ol><li>打开相机和简单PCI成像软件。点击"在线"，以允许调整的成像条件。 </li><li>设置的视频条件如下:增益= 0;光模式=高;速度指数= 1;分级= 2.单击"自动暴露"，然后调整照明条件下，移动显微镜镜和亮度和对比度拨号。 注:视频需要具有高的对比度而不曝光过度osed，从而使动物出现在明亮的背景为黑色的形状。 </li><li>点击"时间扫描"，然后选择一个文件夹和文件名。设置"现场延迟"到20毫秒，"停止在时间"，以30秒。按"在线评论"，以便选择该板的面积来记录（其中，最蠕虫）。酶标板3次或4次在舞台上，快速确认其观点，按"开始"领域的地位。 </li><li>之后，电影拍摄完成后，右键单击图像，然后选择"导出蒙太奇序列"的电影从.cxd格式导出到一个.avi。 </li></ol></li><li>分析蠕动视频<ol><li>打开ImageJ的软件，进入"插件"选项卡，然后在"wrmtrck"，然后选择"wrMTrck批"。选择包含​​的所有文件的目录来进行分析。 </li><li>在wrMTrck_Batch的主输入窗口，如在造型玩具详述加载的输入值Ë5C。对于每个参数的解释可以在附带的插件的说明中找到。点击"OK"，让运动分析运行。 </li><li>为策展的结果，并确认所有检测到的轨道与实际C.线虫和消除文物，打开每个为每部电影创建的.txt文件和复制信息到数据分析软件的文件。打开创建的"* _labels.zip"文件，并运行所产生的"* _labels.tif"手动检查并消除虚假蠕虫轨道。 </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

此处所描述的方法有助于说明扩频和朊病毒样蛋白的复杂细胞中自主和非细胞自主毒性。我们最近发现，一个聚集倾向的胞质朊病毒域被吸收到膜结合的囊泡中的自噬相关的过程。这些囊泡的特定子集运内和细胞和组织40之间的朊病 ​​毒域。监测其在活的动物运动的关键是，该蛋白质必须具有标记MRFP，因为只有MRFP标签蛋白均在这些推测酸性囊泡可见。用同样的方法，我们目前正在研究的某些与疾病相关的蛋白质，如超氧化物歧化酶1（SOD1）（链接到ALS），α-突触核蛋白（与PD）或TAR DNA结合蛋白的潜在朊病毒样行为43（TDP-43）（与ALS）。虽然囊泡内这间运输似乎被其他几种蛋白质，可能会有一个dditional途径，使传播。 使用精心折叠的特点是传感器的一个强大的工具来监控细胞蛋白质折叠环境C.上的影响线虫 63-66。这里，我们已经示出了如何使用荧光的年龄依赖性累积标记为易聚集蛋白下的组织特异性启动子表达，以在视觉上同时监视折叠容量明显的组织。其他的可能性，研究有机体proteostasis网络包括使用内源性TS突变蛋白。这些亚稳蛋白将正常在允许温度（15℃），但错误折叠而成为非功能性的限制温度（25℃）下，表现出其特性的突变体的表型。在一个易聚集蛋白的存在或老化过程中，该TS突变表型得到即使在允许的条件下63-66暴露出来。其中的一些TS突变体被表达在邻NLY组织或表现出组织特异性的表型的子集，使得这些特别有用的，以测试细胞中自主和非细胞自主proteotoxic影响。例如，一个TS突变LET-60，GTP结合的RAS原癌基因家族中的一员，拉斯（TS），普遍表达的，但显示了组织特异性突变表型63,66。通过使用该TS突变体，的polyQ扩展蜂窝proteostasis上的效果被证明是细胞中自主63。的polyQ中的ras基因（TS）的遗传背景表达揭示只特定于该蛋白表达的组织中的突变体的表型。多重突变体的表型的曝光将指示一个蛋白具有非细胞自主proteotoxic影响。 此外，为了测试对细胞应激途径的影响，有一个大的选择的体内荧光应力记者在C.线虫 72。这些通常是转录人记者，下一个胁迫诱导型启动子表达绿色荧光蛋白（GFP），如HSP-16.2p或草皮-3P，在热或氧化胁迫，分别72报告。通过使用适当的记者，在与朊病毒样蛋白结合，人们可以监测应激反应的电位感应组织中比1表示各自的转基因其他。一个警告，然而，就是这些压力记者往往不够敏感透露给定的途径（未发表意见）的微妙上调。 我们追求以检查是否基因影响非细胞毒性自治也影响蛋白质的蔓延，我们开始通过筛选基因，当被击倒，将改善运动缺陷。使用可视化的游泳速度作为评价一个读出，我们能够从容地检测〜每节25板并进行两轮每周此协议，导致完成6个星期内的初始画面。命中的确认，通过在固体板蜗杆运动进行定量分析，一式三份，用wrMTrck在额外3周执行。一个警告，但是，是通过使用爬行在板代替游泳在液体介质如一个读出1可能会失去某些候选基因，如游泳和爬行是不相同的动作，并且可以通过不同的途径73的影响。因此，如果一些候选基因不能在固体板进行确认，应在液体介质中，在这里游泳可以通过一个给定的时间内计数脱粒频率被量化重新测试。 这里描述的筛选协议使用自动液体处理工作站，这大大降低了变异性。它的缺点是，需要过量的流体为机器人的水库，这可能不总是可行的。这种筛选的设置，可以很容易地适应于C.其他屏幕线虫&lt;/ em&gt;的该使用抖动作为读out.This屏幕不被设计来直接确定基因影响朊病毒域的扩频或者非细胞自主毒性，如全基因组画面应该在设计简单，以便进行及时。蠕动的缺陷可以源自不仅从肌肉，但也从神经元损伤和从其他一些基因缺陷53。因此，通过使用这个读出，我们可能会发现肌肉特异性毒性不仅改性剂。我们目前正在测试的候选基因及其效果上朊病毒域扩展，并使用上述方法的非细胞自主毒性。这些实验将最终揭示跨细胞蛋白质聚集体的扩散是否有直接联系的其它组织，或者如果细胞至细胞传播和非细胞自主毒性可以是未偶联的观察到的毒性。 两者合计，所描述的方法可用于检查潜在PR蛋白质在用C的细胞和有机体水平离子样行为线虫 。

许多神经变性疾病，包括阿尔茨海默氏病（AD），帕金森氏病（PD），肌萎缩性侧索硬化症（ALS），和传染性海绵状脑病（海绵状脑病），都与聚集倾向的蛋白质相关联，并且因而是统称为蛋白质错误折叠疾病（PMDS ）。的TSE或朊病毒病构成一类独特的PMD的，因为它们可以是传染性在人类和动物1。在分子水平上，朊病毒复制招募和单体α螺旋丰富的主机编码细胞朊蛋白（PRP C）转换成病理β折叠丰富的朊蛋白构象钪2,3。自我繁殖的蛋白质聚集体已经还确定了真菌，它与哺乳动物朊病毒4,5共享的重要特征。此外，哺乳动物朊病毒能够从细胞至细胞移动及感染幼稚细胞6,7。 而超视距的PMD呃不是传染性海绵状脑病是不会传染的，他们与朊病毒疾病8,9都有一个共同的致病原理。虽然链接到每个所述的PMD的蛋白质的结构或功能是不相关的，它们经由一个结晶状过程中的所有形式的聚集体称为有核或接种聚合;而且蛋白质的种子长出通过招募他们的可溶性亚型2,10,11。效率，以自我传播体内而变化，这取决于蛋白的固有性质，连同另外的细胞因子，如分子伴侣最终确定聚合成核，播种，碎裂和扩频12-15的速率。因此，必须存在这些因素之间，允许蛋白质聚集的有效传播一个微妙的平衡。这可能也解释了为什么只有某些淀粉样蛋白聚集怀有朊病毒的特点，因而并不是所有的PMD都具有传染性。朊病毒似乎代表"顶级表演&#39;O广发自我复制的蛋白质聚集的频谱，这使得他们的强大工具来研究的PMD 8,13。 有趣的是，与疾病相关的聚集相关的毒性经常具有非细胞自主组件16,17。这意味着，它们影响邻近的细胞不表达相应的基因，而相比之下，严格细胞自主的效果，这意味着只有该细胞表达该基因表现出特定的表型。这是令人信服由组织特异性表达证实或敲在神经变性疾病18-26的众多模型的各蛋白质的向下。各种机制被建议作为用于这种非细胞中的PMD自主毒性，包括减少营养供给，失衡神经信号，谷氨酸兴奋毒性，和神经炎症16,27,28的基础。此外，疾病联的聚集体的细胞之间的朊病毒样运动migh吨有助于这方面的29,30。越来越多的证据表明，其它蛋白质夹杂比朊病毒可以从细胞-细胞传递，这可以解释病理学在许多的PMD 30-36观察的特征传播。然而，它尚未确定是否有疾病的蛋白质的细胞间移动和对邻近细胞的毒性效果之间的明确的因果关系。因此，更好地理解所依据的细胞至细胞传播和非细胞自主毒性的细胞途径的是必要的和必不可少的新疗法的发展。然而，朊病毒状扩频和细胞因子的许多方面，影响在后生动物细胞 - 细胞传输错误折叠的蛋白质都没有很好地理解，特别是在有机体的水平。 该线虫具有提供潜力几个优点 发现的朊病毒样spreadi新层面纳克在后生动物17。它是透明的，允许在体内跟踪的荧光标记的蛋白在活的有机体。此外，受疾病的许多细胞和生理过程是从蠕虫到人类的保守，和C.线虫也是适合于各种各样的遗传操作和分子和生物化学分析37-39的。正是959的体细胞组成成人雌雄同体用一个简单的身体的计划，仍然有几个不同的组织类型，包括肌肉，神经元和肠。 要建立C.一个新的朊病 ​​毒模型线虫，我们选择了外源表达的良好表征谷氨酰胺/天冬酰胺（Q / N）的胞质酵母朊病毒Sup35的富朊病毒域NM，因为有在蠕虫4,40没有已知的内源性朊病毒蛋白。酵母朊病毒已经非常宝贵的阐明朊病毒复制41-44的基本机制。此外，NM是杉木已被证明扼要重述朊病毒的整个生命周期中的哺乳动物细胞培养45,46 ST胞质朊状蛋白质。同样地，在C时表示线虫 ，通过非常好，为在后生动物细胞繁殖的不同的要求相比，酵母细胞和朊病毒生物学表现关键特征40。NM聚集了深刻的毒性表型相关联，包括线粒体完整性和外观的破坏的Sup35朊病毒域各种自噬相关囊泡在细胞水平上，以及胚胎和幼虫逮捕，发育迟缓，并在有机体水平的蛋白质折叠的环境的一个普遍的干扰。引人注目的是，朊病毒域表现出细胞中自主和非细胞自主毒性，影响相邻的组织，其中，转基因不表达。此外，内和细胞间的朊病毒域的囊泡运输监测实时&lt;EM&gt;在体内40。 在这里，我们将介绍如何检查朊病毒般传播C.线虫 。我们将解释如何监控含使用时间推移荧光显微镜朊病毒域囊泡内和细胞间的运输。我们将强调使用组织特异性折叠传感器和遍在表达的应力记者，以评估对细胞的健身细胞中自主和非细胞自主效应。最后，我们将描述一个最近执行的全基因组RNA干扰（RNAi）屏幕的方法来识别朊病毒诱导的毒性的新调节剂。总之，这些方法可以帮助捉弄除了参与蛋白质的细胞间运动及其非细胞毒性自主遗传途径。

<table><tbody><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosphere size standards 100 nm</td><td>ThermoScientific</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ahringer RNAi library</td><td>Source BioScience LifeSciences&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience&lt;br/&gt; .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td><td>ThermoScientific</td><td>75004521</td><td>http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_&lt;br/&gt; XTR_Refrigerated_Centrifuge_120&lt;br/&gt; VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td>96 pin replicator&amp;nbsp;</td><td>Scionomix&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr><tr><td>HiGro high-capacity, incubating shaker&amp;nbsp;</td><td>Digilab</td><td></td><td>http://www.digilabglobal.com/higro</td></tr><tr><td>Multidrop Combi Reagent Dispenser&amp;nbsp;</td><td>Titertrek</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td></tr><tr><td>Biomek FX AP96 Automated Workstation&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>Innova44 shaker</td><td>New Brunswick</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&amp;amp;pb=d78efbc05310ec&lt;br/&gt; 04&amp;amp;action=products&amp;amp;contentid=1&amp;amp;&lt;br/&gt; catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td></tr><tr><td>ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td></tr><tr><td>Spinning Disc AF Confocal Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td></tr><tr><td>Falcon 4M60 camera&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Dalsa&amp;nbsp;</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Microscopy Automation &amp;amp; Image Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td></tr><tr><td>Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td><td>Meyer Instruments</td><td></td><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>wrMTrck plugin for ImageJ</td><td></td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (WT)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td><td>Morimoto lab</td><td></td><td>available from our laboratory&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

监测细胞间的朊病 ​​毒样蛋白扩频通过体内延时成像 转基因C.线虫系表达朊病毒域是特别适合的朊病 ​​毒样蛋白， 例如 ，细胞至细胞传播和非细胞自主毒性某些方面的分析。使得能够追踪的荧光动物的透明度从活体内标记的蛋白在生命的各个阶段。趁着此，跨细胞和使用荧光显微镜组织朊状蛋白质运动被可视化。一个63X或100X / 1.4NA油的目的是要解决的泡状结构。重要的是，朊病毒域必须被标记为MRFP，为了这些推测酸性小泡40内保持荧光可见。黄色荧光蛋白（YFP），它通常用作标签，我不是合适的，因为它是在骤冷的低pH环境40,55。应变AM815表达RFP标记R2E2积聚在管状囊泡（高度聚集倾向的和有毒的朊病 ​​毒域NM的形式），而单 ​​独的RFP标记仍然可溶（ 图1A和B）。使用体内延时成像，它可以被观察到，这些管状囊泡内，并且电池40（ 图1C和D，视频1和2）[地点链接到视频之间输送 1和2在这里。 采用折叠式传感器和压力记者来调查proteostasis和毒性细胞自主和非细胞自主的影响 朊病毒能够穿过种子相关蛋白，破坏细胞蛋白质折叠的环境。这可以通过适当的折叠浅草的共表达透露RS。折叠传感器是依赖官能proteostasis网络上正确折叠的非必要稳蛋白。一些实例是公知的萤火虫萤光素酶和蛋白质窝藏温度敏感（TS）的突变56-66。 proteostasis的破坏导致的记者，其可通过聚集体的目视检查或通过相应TS突变表型的曝光，在许可的温度进行检测的错误折叠。是多聚谷氨酰胺（的polyQ），长度为聚集（约40个残基）的门槛延伸也经常使用，因为它们表现出与年龄相关的聚集67-69。较早出现聚集揭示了一个妥协的折叠环境。在这里，我们采用了一种朊病毒突变RΔ2-5，当在C.表示仍然溶于线虫体壁肌肉（BWM）细胞和小肠40（ 图2A和C）。当同时表达R2E2在BWM细胞，RΔ2-5意图dily聚集体（ 图2B），揭示R2E2对蛋白质折叠环境的细胞自主效应。上proteostasis和感应横跨组织错误折叠的广泛影响可以通过折叠传感器的表达在不表达朊病毒域的高度聚集倾向的形式的截然不同的组织进行评估。 R2E2下一个BWM细胞特异性启动子（ 肌- 3P）表达，而RΔ2-5下一个肠特异性启动子（VHA-6P）来表示。肠RΔ2-5聚集表明R2E2影响蛋白质折叠中的非细胞自主方式40（ 图2D）。代替使用RΔ2-5，其中聚集体只能以高分辨率来检测，使用polyQ44在肠道表达（Q44i）允许聚集体的可视化在立体显微镜下（ 图2E和F）低的分辨率。此外，这使得阴性特质的量化LS与聚集体，以及聚集体的数目的定量。 为了研究朊病毒域的非细胞自主的毒性，我们以前研究邻近组织不通过电子显微镜表达R2E2，发现在肌肉细胞的朊病毒域的表达导致线粒体完整性旁组织非细胞自主中断，这样的作为肠道40。线粒体功能障碍导致增加的活性氧（ROS）生产和氧化应激。非侵入的方式来可视化诱导的氧化应激反应的方法是使用一种氧化应激诱导型报道70。应变CF1553表示下氧化应激诱导型启动子的SOD-3 70的绿色荧光蛋白（GFP）。当越过动物表达在BWM细胞的朊病毒域R2E2，记者在BWM细胞显著上调以及在众多非BWM组织（ <s仲&gt;图3）。该菌株可用于研究是否某些候选基因影响这种非细胞自主诱导的氧化应激反应。 表1提供了C的列表线虫菌株表达折叠传感器和压力记者，可以使用类似。 全基因组画面抑制在C朊病毒诱导的毒性的线虫 朊病毒域的复杂毒性表型C中表示线虫是由于缺乏在大多数观察到的体外朊病毒模型71可辨别毒性的特别有趣的。这种模式可能会揭示新的通路，可以影响与后生动物朊病毒相关的毒性。为了解决这个问题，我们已筛选的基因，当RNAi的耗尽，将改善R2E2转基因动物的运动缺陷。对照处理的WT蠕虫可以用作阳性共ntrol，虽然大多数的候选基因，将不提供完整的运动表现型救援，由于可变外显率的RNAi和转基因的高毒性。动物4天分别用RNA干扰，从第一幼虫状态L1到成年期的第2天。到那时，未处理R2E2动物的抖动比WT动物的抖动，这是非常重要的，因为我们筛选运动的改进显著慢。 F1代将存在（〜L1S），但很容易从P0代区分。只有P0一代得分。这个初始屏幕是视觉和非定量的，因此，低的阈值被用来确定初步命中的，这意味着每一个细菌的RNAi克隆似乎增加朊病毒表达动物的颠簸被重新测试以定量爬行测定。 图4概述了主要步骤的屏幕设置的。高分辨率猎鹰4M60相机启用了QUAR的视觉筛查板之三的时间的计算机屏幕上，这使得屏幕以更有效地完成。而有帮助的，这是没有必要的。蠕虫抖动的目视检查，也可以通过使用立体镜在低放大倍数（10×）来进行。 初步筛选命中确认 高通量筛选执行作为一种方法，它允许分析基因组范围的影响，得到能够通过互补的方法进行精制的候选基因的一个主列表。屏幕效果验证因此，必须消除可能的误报，这可能是由于只有一元的RNAi实验样品进行屏幕。 R2E2转基因动物饲以初级命中件的RNAi克隆并测定对成年的第二天它们对NGM板速度，运动的量化的读出和降低的毒性。我们使用wrMTrck插件ImageJ的，在我们的发展实验室，准确地识别C.线虫在视频和遵循他们的运动。该wrMTrck插件和自动分析脚本是开源的，并公开提供http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html，以及如何使用它的详细说明。下载后，复制整个wrMTrck文件夹的ImageJ的插件文件夹中。本协议描述的wrMTrck_Batch方法，优先用于分析在一个时间大量的影片，但同时也可以在插件下载为手动，电影由电影指令，分析。 WrMTrck_Batch变换原始视频（ 图5A）与背景减除二进制格式和每个蜗杆被分配一个轨道。每个经处理的视频以后可以与这些轨道重叠观察时，以手动消除被错误地确定为蠕虫（ 例如 ，磁迹1的图5B）的任何工件。消除背景技术一种有效的方法<html> ifacts（与图5B上的箭头指示）是要谨慎选择的对象的被识别的最小和最大尺寸（ 图5C）。从wrMTrck插件的不同输出，我们使用每秒主体长度（BLPS）参数，其测量每只动物的平均速度，通过各磁道按每个对象的体长度划分的长度来表示，从而对归一化的电势差在线虫（ 图5D）的大小。使用这种方法，我们确定了35抑制器朊病毒诱导的毒性（SOPT），该增加的运动表现型中R2E2表达C的线虫到至少133％，并高达256％相比，空载体治疗蠕虫（ 图6）。这些SOPT基因代表最终证实命中，导致我们的高通量筛选的努力。 21fig1highres.jpg"/&gt; 图1.朊病毒域的细胞和组织中的C之间传播线虫通过囊泡运输。（A）折叠共聚焦的z栈线虫表达RFP的体壁肌肉（BWM）细胞（RFPm）的。（B）折叠共聚焦的z栈线虫表达剧毒，易聚集NM变种，R2E2中BWM细胞（R2E2m）。箭头表示管状囊泡，箭头表示集合体。（C + D）的时间推移系列动物表达RFPm（C）和R2E2m（D）中 。箭头表示泡状运动的领域。 RFPm展品大多是弥漫性染色。即使RFPm在囊泡发现，这些几乎没有移动。 R2E2m定位于那些内部和细胞之间的运送大量囊泡。比例尺:10微米。附带的视频1和2 [地方链接视频1和2在这里]对应于图1C和D，分别。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/52321/figure2_test.jpg" /> 图2.折叠传感器显示的proteostasis朊病毒领域的广泛影响。 R2E2m的（A + B）共表达促进RΔ2-5m聚集。 （一）RΔ2-5m控制和（B）RΔ2-5m在BWM细胞共表达与R2E2m共聚焦图像。（C + D）肌肉表达R2E2m促进肠道RΔ2-5i聚集。（C）共焦控制动物形象表达RΔ2- 5I在肠细胞。（D）动物BWM细胞和RΔ2-5i在肠道表达R2E2m的共聚焦图像。比例尺:10微米（E + F）R2E2m诱导Q44i非细胞自主聚合（E）Q44i和Q44i代表荧光图像;传输同步L1征地拆迁后4天R2E2m动物。VAE到新鲜OP50种子NGM板。同步之后R2E2在BWM细胞中的表达导致了较早出现在肠Q44i聚集。动物（F）的定量与聚集体（单位:％）上指示天。误差线代表SD这个数字已经被修改40。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig3highres.jpg" /> 图3. SOD-3P :: GFP转录应激记者发现，朊病毒域导致细胞自主和非自主细胞诱导的氧化应激。 （A + B）SOD-3P代表荧光图像（使用相同的曝光时间）:: GFP表达控制的动物（A）和SOD-3P :: GFP; R2E2m动物（B）在成年期第2天（C） R2E2在BWM细胞中的表达导致不仅在BWM细胞感应记者的S（I）中，也可在肠（II）中，神经索（Ⅲ），咽头和神经元（四）。 <img alt="图5" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig5highres.jpg" /> 与wrMTrck插件ImageJ的蠕虫的运动图5.分析。（A）中通过使用适当的倍率（〜10×）的时间来监视几个动物产生的输入电影的实施例。（B）的 "* _labels.tif"文件是wrMTrck_Batch的输出，并允许对分析结果的手工策。箭头表示被正确地从分析中排除的对象，由于最小和最大尺寸的参数的适当选择。wrMTrck_Batch（C）的输入窗口中，示出用于此协议参数。这些参数需要调整根据个体显微镜和电影设置。（D）中从moveme输出结果（二）新台币分析，随着BLPS列以黄色突出显示。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52321/52321fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig6highres.jpg" /> 当相比于阴性对照（空载体） 用的RNAi克隆是朊病毒诱导的毒性（SOPT）抑制器处理图6. R2E2虫显示出改进的蠕动。能动性被示出为相对的BLPS。示出的是所有统计学显著（学生t检验）的RNAi在HTP筛选中鉴定的克隆。 <img alt="黑星" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52321/blackstar.jpg" width="20" />表示示出如在图5的一例的命中。结果来自3的电影，17的&lt;n &lt;53％的条件下轨道。误差棒表示SEM。&lt;/ P&gt; 表1. C.线虫菌株表达折叠传感器和压力记者。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 应变的名字 </td><td> 基因型 </td><td> 评论 </td><td> 应变源 </td></tr><tr><td> 折叠传感器 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 转基因 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> AM140 </td><td> UNC-54P :: polyQ35 :: YFP </td><td>肌肉特异性polyQ35的表达，年龄依赖性聚合</td><td> CGC和森本实验室</td></tr><tr><td> AM141 </td><td> UNC-54P :: polyQ40 :: YFP </td><td> polyQ40，AG的肌肉特异性表达Ë依赖聚集</td><td> CGC和森本实验室</td></tr><tr><td> AM801 </td><td> UNC-54P ::RΔ2-5:: YFP </td><td>成核无能朊病毒域的肌肉特异性表达</td><td>森本实验室</td></tr><tr><td> OG412 </td><td> VHA-6P :: polyQ44 :: YFP </td><td>肠特异性polyQ44的表达，年龄依赖性聚合</td><td> CGC </td></tr><tr><td> AM809 </td><td> VHA-6P ::RΔ2-5:: GFP;肌2P :: mcherry </td><td>核无能朊病毒域的肠特异性表达</td><td>森本实验室</td></tr><tr><td> AM47 </td><td> F25B3.3p :: polyQ40 :: CFP </td><td> polyQ40的神经元特异性表达，细胞类型特异性凝集</td><td>森本实验室</td></tr><tr><td> AM982 </td><td> unc54p ::荧光素酶:: YFP </td><td>的WT萤火虫萤光素酶的肌肉特异性表达</td><td>森本实验室</td></tR&gt; <tr><td></td><td> 肌-3P ::荧光素酶:: GFP; ROL-6 </td><td>的WT萤火虫萤光素酶的肌肉特异性表达</td><td>北京控股实验室</td></tr><tr><td></td><td> SNG-1P ::荧光素酶:: GFP; ROL-6 </td><td>的WT萤火虫萤光素酶的肌肉特异性表达</td><td>北京控股实验室</td></tr><tr><td> FUH55 </td><td> unc54p :: FLUC :: EGFP; ROL-6 </td><td>的WT萤火虫萤光素酶的肌肉特异性表达</td><td>哈特尔实验室</td></tr><tr><td> FUH134 </td><td> unc54p :: FLUCSM :: EGFP; ROL-6 </td><td>的R188Q突变萤火虫萤光素酶的肌肉特异性表达</td><td>哈特尔实验室</td></tr><tr><td> FUH135 </td><td> unc54p :: FLUCDM :: EGFP; ROL-6 </td><td>的R188Q + R261Q双突变萤火虫萤光素酶的肌肉特异性表达</td><td>哈特尔实验室</td></tr><tr><td> FUH48 </td><td> F25B3.3p :: FLUC :: EGFP; ROL-6 </td><td>的WT萤火虫lucifera神经元特异性表达SE </td><td>哈特尔实验室</td></tr><tr><td> FUH136 </td><td> F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; ROL-6 </td><td>的R188Q突变萤火虫萤光素神经元特异性表达</td><td>哈特尔实验室</td></tr><tr><td> FUH137 </td><td> F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; ROL-6 </td><td>的R188Q + R261Q双突变萤火虫萤光素神经元特异性表达</td><td>哈特尔实验室</td></tr><tr><td> TS突变 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CB1402 </td><td> UNC-15（e1402）I </td><td>副肌球蛋白（TS），对温度敏感的联合国军司令部瘫痪，让</td><td> CGC </td></tr><tr><td> CB1157 </td><td> UNC-54（e1157）I </td><td>肌球蛋白（TS），对温度敏感的联合国军司令部</td><td> CGC </td></tr><tr><td> CB1301 </td><td> UNC-54（e1301）I </td><td>肌球蛋白（TS），对温度敏感的联合国军司令部</td><td> CGC </td></tr><tr><td> CB286 </td><td> UNC-45（E286）III </td><td> UNC-45（TS），对温度敏感，缓慢移动的联合国军司令部，EGL </td><td> CGC </td></tr><tr><td> HE250 </td><td> UNC-52（e669su250）II </td><td>串珠素（TS），对温度敏感的联合国军司令部，僵硬瘫痪</td><td> CGC </td></tr><tr><td> SD551 </td><td> 让-60（ga89）IV </td><td> RAS（TS），对温度敏感的MUV，科技教育，让，LVA，OSM </td><td> CGC </td></tr><tr><td> CX51 </td><td> 达因-1（ky51）× </td><td>动力素（TS），对温度敏感的联合国军司令部</td><td> CGC </td></tr><tr><td> CW152 </td><td> 气体-1（FC21）x </td><td>气体-1（TS），对温度敏感的EtOH灵敏度</td><td> CGC </td></tr><tr><td> ZZ26 </td><td> UNC-63（X26）I </td><td>乙酰胆碱受体（TS），对温度敏感的电阻左旋咪唑</td><td> CGC </td></tr><tr><td> 记者压力 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CL2070 </td><td> HSP-16.2p :: GFP; ROL-6 </td><td>热应力; UPR CYTO </td><td> CGC </td></tr><tr><td> TJ375 </td><td> HSP-16.2p :: GFP </td><td>热应力; UPR CYTO </td><td> CGC </td></tr><tr><td> TJ3000，TJ3001 </td><td> HSP-16.2p :: GFP; CBR-UNC-119（+） </td><td>热应力; UPR CYTO </td><td> CGC </td></tr><tr><td> AM446 </td><td> hsp70p :: GFP; ROL-6 </td><td>热应力; UPR CYTO </td><td>森本实验室</td></tr><tr><td> AM722 </td><td> hsp70p :: mcherry;肌2P :: CFP </td><td>热应力; UPR CYTO </td><td>森本实验室</td></tr><tr><td> AM799 </td><td> hsp90p :: GFP </td><td>热应力; UPR CYTO </td><td>森本实验室</td></tr><tr><td> OG497 </td><td> HSF-1P :: HSF-1 :: GFP; CBR-UNC-119（+） </td><td>热应力; UPR CYTO </td><td> CGC </td></tr><tr><td> CF1553 </td><td> SOD-3P :: GFP; ROL-6 </td><td>氧化应激</td><td> CGC </td></tr><tr><td> KN259 </td><td> SOD-3P :: GFP; ROL-6 </td><td>氧化应激</td><td> CGC </td></tr><tr><td> CL2166 </td><td> GST-4P :: GFP :: NLS </td><td>氧化应激</td><td> CGC </td></tr><tr><td> LD1171 </td><td> GCS-1P :: GFP; ROL-6 </td><td>氧化应激</td><td> CGC </td></tr><tr><td> LD1 </td><td> SKN-1P :: SKN-1 :: GFP; ROL-6 </td><td>氧化应激</td><td> CGC </td></tr><tr><td> IG274 </td><td> NLP-29P :: GFP </td><td>渗透胁迫</td><td> CGC </td></tr><tr><td> BC20309 </td><td> MTL-1P :: GFP </td><td>金属压力</td><td>贝利实验室</td></tr><tr><td> BC20342 </td><td> MTL-2P :: GFP </td><td>金属海峡ESS </td><td>贝利实验室</td></tr><tr><td> BC20314 </td><td> ELT-2P :: GFP </td><td>金属压力</td><td>贝利实验室</td></tr><tr><td> SJ4005 </td><td> HSP-4P :: GFP </td><td> UPR ER </td><td> CGC </td></tr><tr><td> SJ4100 </td><td> HSP-6P :: GFP </td><td> UPR 美图 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> SJ4058 </td><td> HSP-60P :: GFP </td><td> UPR 美图 </td><td> CGC </td></tr></tbody></table> CGC:秀丽隐杆线虫遗​​传中心; TS =温度敏感的; UPR =未折叠蛋白反应; CYTO =胞浆;美图=线粒体; ER =内质网。

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans at JoVE.com

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

调查的传播和毒性朊病毒样蛋白使用后生动物模式生物<em&gt;温度。线虫</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.8K 次观看.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

视频: Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

含量测定β-淀粉样蛋白的毒性，使用转基因 C。线虫模型

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

科研

神经科学

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

一<em&gt;线虫</em&gt;研究Amylopathy模型系统

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

使用秀丽隐杆线虫中的自动包涵体计数监测体内蛋白质聚集动力学

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

生物化学

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

利用广域跟踪平台对大型线虫种群进行自动行为分析

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

免疫与感染

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), Huntington&#39;s disease (HD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Protein aggregates are closely associated with neuropathology in these diseases, although the exact mechanism by which aberrant protein aggregation disrupts normal cellular homeostasis is not known. Emerging data provide strong support for the hypothesis that pathogenic aggregates in AD, PD, HD, and ALS have many similarities to prions, which are protein-only infectious agents responsible for the transmissible spongiform encephalopathies. Prions self-replicate by templating the conversion of natively-folded versions of the same protein, causing spread of the aggregation phenotype. How prions and prion-like proteins in AD, PD, HD, and ALS move from one cell to another is currently an area of intense investigation. Here, a Drosophila melanogaster model that permits monitoring of prion-like, cell-to-cell transmission of mutant huntingtin (Htt) aggregates associated with HD is described. This model takes advantage of powerful tools for manipulating transgene expression in many different Drosophila tissues and utilizes a fluorescently-tagged cytoplasmic protein to directly report prion-like transfer of mutant Htt aggregates. Importantly, the approach we describe here can be used to identify novel genes and pathways that mediate spreading of protein aggregates between diverse cell types in vivo. Information gained from these studies will expand the limited understanding of the pathogenic mechanisms that underlie neurodegenerative diseases and reveal new opportunities for therapeutic intervention.

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Accumulating evidence supports the idea that pathogenic protein aggregates associated with neurodegenerative diseases spread between cells with prion-like properties. Here, we describe a method that enables visualization of cell-to-cell spreading of prion-like aggregates in the model organism, Drosophila melanogaster.

监测果蝇中朊病毒样蛋白聚集物的细胞间传输

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>用于研究秀丽隐杆线虫兴奋性中毒性坏死模型中神经退行性的活体动物成像和细胞分选方法

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

用于研究 秀丽隐杆线 虫兴奋性中毒性坏死模型中神经退行性的活体动物成像和细胞分选方法

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

测量在C.elegan的RAN肽毒性

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

生物学

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

建模年龄相关的神经退行性疾病在 卡诺哈布迪蒂斯埃利根

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

调查的传播和毒性朊病毒样蛋白使用后生动物模式生物

摘要

探索更多视频

此视频中的章节

含量测定β-淀粉样蛋白的毒性，使用转基因 C。线虫模型

一

使用秀丽隐杆线虫中的自动包涵体计数监测体内蛋白质聚集动力学

利用广域跟踪平台对大型线虫种群进行自动行为分析

监测果蝇中朊病毒样蛋白聚集物的细胞间传输

用于研究秀丽隐杆线虫兴奋性中毒性坏死模型中神经退行性的活体动物成像和细胞分选方法

用于研究秀丽隐杆线虫兴奋性中毒性坏死模型中神经退行性的活体动物成像和细胞分选方法

测量在C.elegan的RAN肽毒性

量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

建模年龄相关的神经退行性疾病在卡诺哈布迪蒂斯埃利根

调查的传播和毒性朊病毒样蛋白使用后生动物模式生物

摘要

探索更多视频

此视频中的章节

含量测定β-淀粉样蛋白的毒性，使用转基因 C。线虫模型

一

使用秀丽隐杆线虫中的自动包涵体计数监测体内蛋白质聚集动力学

利用广域跟踪平台对大型线虫种群进行自动行为分析

监测果蝇中朊病毒样蛋白聚集物的细胞间传输

用于研究 秀丽隐杆线 虫兴奋性中毒性坏死模型中神经退行性的活体动物成像和细胞分选方法

用于研究 秀丽隐杆线 虫兴奋性中毒性坏死模型中神经退行性的活体动物成像和细胞分选方法

测量在C.elegan的RAN肽毒性

量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

建模年龄相关的神经退行性疾病在 卡诺哈布迪蒂斯埃利根

用于研究秀丽隐杆线虫兴奋性中毒性坏死模型中神经退行性的活体动物成像和细胞分选方法

用于研究秀丽隐杆线虫兴奋性中毒性坏死模型中神经退行性的活体动物成像和细胞分选方法

建模年龄相关的神经退行性疾病在卡诺哈布迪蒂斯埃利根