噬菌体转导:将氨基青霉素耐药性从捐赠者转移到受体大肠杆菌的方法

1. 在开始任何涉及微生物的工作之前，使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒。始终使用必要的个人防护装备（实验室外套和手套）。
2. 确保 LB 琼脂板含有 1x 阿霉素，市售 P1 噬菌体莱酸溶液、氯仿、1 M 柠酸钠、甘油以及一盒预消毒塑料移液器尖端和细胞扩散器。
3. 通过高压灭菌制备无菌LB，并用它来制造三个1 mL等分的LB盐溶液。
   1. mM MgCl₂ （952.11-2.3803 μg）， 5 mM CaCl₂ （11.098 毫克）， 0.1-0.2% 葡萄糖 （100-200 μg）
   2. mM MgSO₄ （12.0366毫克）， 5 mM CaCl₂ （11.098毫克）
   3. mM柠酸钠 （25.806毫克）
4. 完成后，用70%乙醇消毒所有表面和手套，然后洗手。

2. 议定书

1. 捐赠者噬菌体莱萨特制剂
   1. 在 LB 中制备 1 mL 的供体 W3110 菌株大肠杆菌，在 37°C 下一夜之间生长 1 倍的阿霉素，在 220 rpm 转速下进行曝气和摇动。
   2. 稀释此过夜培养物 1:100 在 1 mL 新鲜 LB 补充 10-25 mM MgCl_2，5 mM CaCl₂和 0.1-0.2% 葡萄糖.
   3. 在 37°C 下生长此细菌稀释 2 小时，在 220 rpm 下进行曝气和摇动。
   4. 一旦这些细胞达到早期对数生长阶段（明显生长和轻微浊度），加入40μL的商用P1噬菌体，并在37°C离开，在220rpm下曝气和摇动。
      1. 在添加噬菌体之前，这些细胞在600nm处测得的光学密度应约为0.4（6）。
   5. 监测细胞1-3小时，直到培养细胞被感染。
      1. 流变将导致细胞碎片增加，以及浊度显著下降（即一旦能够看到培养物，细胞将被视为分莱体）。
   6. 将几滴（50-100 μL）氯仿加入流合物，然后通过涡旋混合。
      1. 氯仿通过杀死任何剩余的供体细胞来灭菌噬菌体，只留下噬菌体并增加这种莱沙的叶的叶蒂。
   7. 在 14，000 rpm 转速下离心式莱沙2分钟，以清除碎屑并将上清液转移到新管中。
   8. 加入几滴氯仿，在4°C下储存不超过一天。
2. 转 导
   1. 制备受体 J53 菌株大肠杆菌的 1 mL 培养，在 LB 中以 37°C 在 LB 中生长过夜，在 220 rpm 下进行曝气和摇动。
   2. 将100 μL的供体噬菌体解结素（2.1）转移到1.5 mL微管中，在37°C下打开盖子孵育30分钟。
      1. 这种孵育允许在添加到受体细胞之前蒸发P1解液中剩余的氯仿。
   3. 在 6，000 rpm 转速下轻轻颗粒受体应变细胞 5 分钟。
   4. 将这些细胞重新悬浮在含有100 mM MgSO₄和5 mM CaCl 2的300μL新鲜LB_中。（P1噬菌体要求钙具有传染性）。
   5. 使用受体细菌细胞和制备的供体噬菌体解结剂设置两种反应:1）转导反应结合100μL受体J53菌株大肠杆菌和100μL供体噬菌体莱沙发生，2）负对照结合100μL受体J53菌株大肠杆菌和100 μL的LB含有100 mM MgSO₄和5 mM CaCl₂.
   6. 在 37°C 孵育 30 分钟，在 220 rpm 下摇动。
   7. 加入 1 mL LB 和 200 μL 1M 柠酸钠 （pH=5.5），在 37°C 下孵育 1 小时，在 220 rpm 转速下摇动。
      1. 柠酸盐用于降低P1的传染性，通过与钙结合，防止受体细菌的裂化。
      2. 此溶液的孵育允许表达安培林电阻标记。
   8. 在 6，000 rpm 转速下离心的颗粒细胞，5 分钟。
   9. 将细胞颗粒与 100 mM 柠子酸钠 （pH 5.5） 重新悬浮在 100 μL 的 LB 中。涡旋和板整个溶液，用于两个LB琼脂板上的两种反应。
      1. LB 板应具有 1x 安培用于转导样品，无安培用于负控制。
      2. 此板上的 P1 噬菌体污染要求在准备冷冻库之前重新进行再条纹。
      3. 如果不去除噬菌体，从这些菌落中生长的培养物将不会生长，除非存在钙包剂。
   10. 从两个板中挑选约 3-4 个菌落，并在两个 LB 琼脂板上再次采摘，其分布为 100 μL 的 1 M 柠酸钠 （pH=5.5）。
       1. LB 板应具有 1x 安培用于转导样品，无安培用于负控制。
   11. 在37°C过夜孵育板，使无噬菌体菌落生长。
   12. 从两个板中挑选菌落，并在 37°C 下用 5 mL 的 LB 生长过夜培养物，在 220 rpm 下进行曝气和摇动。
   13. 使用总培养量的4.5 mL，通过DNA小制备从这些培养物中分离DNA。
       1. 使用35μL无核酸酶水的脱氧核糖核酸。
       2. 通过纳米滴测量产生的浓度。纯DNA将产生约1.8的吸收比（A_{260/280）。}
   14. 使用每种培养物的剩余 0.5 mL，通过 1:1 甘油和细菌培养物的 1:1 混合物制备 1 mL 甘油。
   15. 将细菌甘油储存在-80°C。

3. 数据分析和结果

1. qPCR 转导确认
   1. 为6种qPCR反应准备两个qPCR主混合物，三个用于环酸素抗基因的qPCR引物，另外三个使用qPCR引物进行内务基因（每个反应14.5μL）:12.5μL qPCR缓冲液混合= 1μL正向引物+ 1μL反向引物。
      1. 在这个实验中，我们使用了SYBR绿色主组合。
      2. 家政基因引物被设计为在DNA陀螺仪B（7）的细菌基因编码中扩增一段DNA。
   2. 对于每个qPCR反应，将每种反应的100μgDNA（10.5μL）与14.5μL的qPCR主混合物混合。
   3. 使用qPCR机和表1中列出的热循环方案，对所有六种反应的环二苯抗性和内务管理基因进行了扩增。
   4. qPCR生成的Cq值用于计算氨基林抗性基因的正态转导效率（图3），确认氨基林抗性基因转导成功。
      1. 样品的 Cq 值或周期量化值是检测到信号超过背景阈值的最早的 PCR 周期数。低 Cq 值对应于更多目标序列，反之亦然。
      2. 样品中基因的标准化转导效率可以通过从这些Cq值中减去目标基因中管理基因的值来计算，生成一个μCq值，可用于计算规范化转导效率由 2^（-+Cq）.

表1:qPCR热循环协议