使用自适应氯化钙程序对大肠杆菌细胞的转化

该协议描述了使用氯化钙程序（12）的适应，制备和转化合格的大肠杆菌DH5+。

1. 设置

1. 设备
   • 分 光 光度计
   • 索瓦尔离心机（或等效）
   • 台式离心机
   • 热块或水浴
   • 轨道摇床
   • 固定孵化器
   • 凝胶铸造托盘
   • 井梳
   • 电压源
   • 凝胶盒
   • 紫外线光源
   • 微波
2. 解决方案和试剂
   • Luria-Bertani （LB） 汤 （10 g 酸酶水解液， 5 g 酵母提取物和 5 g 氯化钠在 1000 mL H₂O））
   • 具有催化素抑制 （SOC） 的超级最佳肉汤: （2% （w/v） 锥酮， 0.5% （w/v） 酵母提取物， 10 mM NaCl， 2.5 mM KCl， 10 mM MgCl_2，10 mM MgSO₄和 20 mM 葡萄糖）
   • CaCl₂-MgCl₂ （80 mM MgCl₂， 20 mM CaCl₂） 溶液.
   • M CaCl₂溶液（如果细胞将立即转化）或 0.1M CaCl₂溶液，含有 10% （v/v） 甘油（如果细胞将冷冻供将来使用）。
   • LB 琼脂板
   • LB琼脂蛋白选择性板（对于本实验，由于使用的质粒具有环异素电阻，因此使用了含有安霉素100μg/mL的LB琼脂蛋白板）
   • 大肠杆菌DH5+菌株
   • 疟原虫 pUC19 DNA （100 pg/ μl）
   • QIAprep 旋转迷你套件（奇根）
   • 欣德III 限制酶
   • 1 kb 加上 DNA 梯子
   • 低熔点阿加罗斯
   • 1X TAE 缓冲液（40 mM 三元底座、20 mM 醋酸和 1mM EDTA）
   • 溴化物（10mg/mL）
3. 一般安全说明
   大肠杆菌DH5+被归类为生物安全等级1（BSL1）。这类微生物对健康成年人的感染威胁很小或根本没有威胁。然而，需要仔细操作微生物。

重要，本协议中的所有步骤都需要使用无菌技术，在冰或4°C温度下执行，除非另有说明。

2. 议定书

1. 从冷冻的大肠杆菌DH5+（从在LB生长的过夜培养物中冷冻20%甘油）中分离出细菌在LB琼脂板上分离。 在 37°C 过夜（16-20 小时）孵育。
2. 在管中接种单个菌落到 3 mL 的 LB 肉汤中。在 37°C 过夜（16-20 小时）下，在 210 rpm 下摇动。
3. 测量隔夜培养的 OD600。使用隔夜培养剂在 1 升烧瓶中接种 100 mL 的 LB 肉汤至 OD600±0.01。每 15-20 分钟在分光光度计中监测 OD600 的 37°C 下大力孵化培养体（210 rpm），直到培养达到 OD600±0.35（约 3 小时）。
   注:为了有效地转化，细菌细胞需要处于指数中生长阶段。细胞的最大数量需要为10⁸个细胞/mL，对于大多数大肠杆菌菌株，该细胞数对应于OD600=0.4。使用分光光度计可以测量OD600，从而确定细胞处于适当的生长阶段。如果此协议将用于其他菌株，则需要校准以确定以特定 OD600 值形成单位的菌落数量，以确定此相关性。
4. 将培养的 50 mL 转移到 2 个冰冷的聚丙烯离心瓶中。将瓶子放在冰上20分钟冷却。
5. 在 2700g（Sorval GSA 转子中 4100 rpm）下，在 4°C 下通过离心回收电池 10 分钟。
6. 拆下上清液。将瓶子倒置放在垫子或纸巾上，将最后的痕迹排干。
7. 将每个细菌颗粒重新悬浮到 30 mL 的 CaCl₂-MgCl₂ （80 mM MgCl₂， 20 mM CaCl_2）冰冷的溶液中。首先加入5 mL的溶液，仔细旋转，直到颗粒完全溶解，然后加入剩余的25 mL溶液。
8. 重复步骤 2.4。
9. 重复步骤 2.5。
10. 如果主管细胞要直接转化，请小心地旋转管，将每个细菌颗粒重新悬浮到 2 mL 的 CaCl₂ （0.1 M） 冷冰溶液中。如果使用此方法颗粒未重新悬浮，请通过轻轻上下移液（避免气泡形成）重新悬浮。
    或者，可以冷冻和储存适合的细胞，以供以后使用。要制备合格细胞的冷冻库存，将颗粒重新悬浮在含有10%（v/v）甘油的0.1M CaCl₂溶液中的2ml。此解决方案需要冰冷。等分电池悬浮液放入冰冷的1.5 mL聚丙烯管中（每管160μl）。立即在干冰/乙醇浴中冷冻合格细胞。将管转移到-70°C冷冻室。
11. 要转化CaCl₂处理的细胞，将50μl的合格细胞转移到2个1.5ml聚丙烯管中。将pUC19质粒DNA的1μl（100 pg）添加到其中一个管中，使第二管没有DNA（阴性对照）。轻轻混合（避免气泡形成）。在冰上孵育30分钟。
    注:在转化时，在10μL或以下的体积中，DNA的DNA不应超过50 ng。
12. 将管子转移到热块，并在42°C下孵育45s。
    注:热冲击是关键步骤。不要超过温度或孵育时间。
13. 容易将管子转移到冰上。孵育2分钟。
14. 加入950μL的SOC培养基，在37°C下孵育管1小时，使细菌恢复并表达质粒中编码的抗生素耐药标记。
15. 在SOC（1/100稀释）中稀释1000μL的细胞悬浮液，在SOC（1/10稀释）中稀释1000μL的细胞悬浮液。将100μl的稀释剂以及控制板板涂到选择性板上，并用铲子扩散。通常，电镀 100 μL 的 1/100 和 1/10 稀释将产生足够的孔组形成单位 （cfu） 每个板的数量。理想情况下，这个数字应在30-300cfu之间，以便有足够的殖民地，但彼此分离。但是，cfu 的数量将取决于转换效率（请参阅数据分析和结果部分）。
16. 在 37°C 下孵育板。转化的菌落应在12-16小时内出现（此范围将取决于细胞菌株和选择方法）。任何殖民地都不应在消极的控制下生长。
17. 计数为变换获取的 cfu/板 （表 1）。
18. 为了验证转化物含有pUC19质粒，将进行质粒制备和随后的消化。为此，在管中接种单个菌落，将3ml LB汤中接种。在 37°C 过夜（16-20 小时）下，在 210 rpm 下摇动。
19. 根据制造商的说明，使用 QIAprep 旋转迷你套件准备质粒制剂。
20. 在37°C下用限制性酶HindIII消化1μg纯化pUC19，1小时。
    注: 任何在pUC19多个克隆位点中切开的酶都可以用于此步骤。

组件	量
10X 限制消化缓冲器	2.5 μl
疟原虫 pUC19	1 μg
欣德Ⅲ	1 μl
H2O	20.5 μl （至 25 μl）

21. 运行分子量阶梯，在含有1微克/mL溴化钠的1%腺胶凝胶中消化pUC19DNA和相同数量的未消化pUC19DNA，在95 V下1小时。
    注:时间和电压因使用的设备而异。
22. 在紫外光下可视化凝胶。比较消化和未消化的pUC19 DNA的大小（图2）（参见数据分析和结果部分）。
    继续执行必要的步骤，根据每个特定转换实验的目标验证转换。

图2:从转化的DH5+细胞中消化恢复的质粒DNA。疟原体DNA是从经过改造的DH5®细胞中恢复的，用HindIII消化，在1%的角胶凝胶中运行，并用紫外线源（步骤2.19至2.22）可视化。

3. 数据分析和结果

为了计算转化效率，这是细胞在细胞外DNA中所占的一个指标，需要计算在转化中获得的菌落:

稀释	克福
1/100	34
1/10	246

表1:从变换实验中计算的菌落成形单位（cfu）。

转化效率 （TE） 是将 1 μg 质粒转化为给定容量的合格细胞所产生的 cfu 数量的度量。许多参数影响转化效率:质粒大小、细胞基因型、能力制备期间的生长阶段、转化方法等。在计算 TE 时，必须考虑在电镀之前执行了稀释（如果有），并将其纳入 cfu 的总数计算中。转换效率 （TE） 使用以下公式计算:

首先将 cfu 除以 DNA 的 μg，在此示例中为 0.0001μg。然后除以稀释系数的结果。在此示例中，使用 1/10 稀释，1 ml 溶液的 100μL 被镀（稀释: 1/10 × 100 μL /1000 μL = 0.01）。