يهدف هذا البحث إلى تصميم وتقديم محررين لعلم الجينوم في الخلايا البشرية. نقوم بذلك عن طريق دمج مؤثرات الكروماتين في dCas9 لتعديل الجينات المستهدفة دون إدخال فواصل حمض نووي سامة. تدور التحديات حول توصيل محرري epigenome بكفاءة إلى الخلايا وضمان خصوصية الهدف بدقة.
بالإضافة إلى ذلك ، لا يزال تحقيق قمع جيني مستقر أو عابر أمرا صعبا. يتجنب هذا البروتوكول أي آليات للانقسام ، مما يقلل من السمية وعدم الاستقرار الجيني. يصف طريقتين للتسليم لتعديل التعبير الجيني المتحكم فيه دون تغييرات دائمة في تسلسل الحمض النووي.
يمكن تطبيق هذه الطرق لاختبار اندماجات مختلفة ل dCas9 ولدراسة بيولوجيا الكروماتين الأساسية. يمكن استخدام محرري الإبيجينوم الحاليين للشاشات على مستوى الجينوم ولديهم القدرة على التطبيقات العلاجية. للبدء ، احتفظ بخلايا K-562 في قارورة مع وسائط RPMI مكملة بنسبة 10٪ FBS والبنسلين ستربتومايسين الجلوتامين.
في يوم النواة ، قم بإذابة CRISPRoff mRNA في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم خال من RNAse وقم بدوامة الأنبوب برفق. استخدم ميكروغرامين من الرنا المرسال لكل 2.0 في 10 إلى قوة خمس خلايا في كل بئر من أنبوب شريط تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضوع على الجليد. قم بإعداد محلول النواة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واتركه يسخن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل النواة.
احصد وعد خلايا K-562 باستخدام عداد خلوي آلي مع تلطيخ حي / ميت باللون الأزرق تريبان. بالنسبة للنوة في كوفيت شريطي ، قم بنقل ما يقرب من مرتين في 10 أس قوة خمس خلايا لكل عينة في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. الطرد المركزي للخلايا عند 500 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تخلص من المادة الطافية. أضف PBS بدرجة حرارة الغرفة إلى حبيبات الخلية وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 500 جم لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق الخلايا في الكمية المناسبة من محلول النواة. أضف الحجم المحسوب لمحلول الخلية إلى ميكروغرامين من محلول CRISPRoff. انقل الخلية ومحلول الرنا المرسال إلى كوفيت ، مع التأكد من عدم تشكل الفقاعات ، لأن هذا قد يضر بكفاءة النواة.
اضغط برفق على Nucleocuvette لتسوية الخلايا في الأسفل. بعد ذلك ، قم بتوصيل الخلايا باستخدام نظام 4D-Nucleofector باستخدام رمز النبض المناسب. قد يحتاج رمز النبض إلى التحسين لأنواع الخلايا المختلفة.
استشر الشركة المصنعة إذا كانت هناك حاجة إلى تحسين إضافي. بعد النواة ، أضف 80 ميكرولترا من وسائط RPMI إلى كل بئر مستخدم من Nucleocuvette. انقل معلق الخلية إلى بئر من صفيحة 24 بئرا تحتوي على 400 ميكرولتر من وسائط RPMI الدافئة مسبقا.
قم بتحميل جميع ملفات قياس التدفق الخلوي القياسي، أو FSC، في FlowJo عن طريق سحبها وإفلاتها في ورقة عمل جديدة. انقر فوق جميع العينات لبدء صنع البوابات. افتح نموذج تحكم بالنقر المزدوج على الملف المقابل.
قم بإنشاء بوابة للخلايا الحية في مخطط FSC-A مقابل SSC-A باستخدام أداة المضلع. يجب أن تظهر علامة تبويب الخلايا المباشرة الآن أسفل اسم العينة في قائمة جميع العينات. انقر بزر الماوس الأيمن على هذه البوابة وحدد نسخ التحليل للتجميع لتطبيق هذه البوابة على جميع العينات.
انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة الخلايا الحية لتحديد الخلايا الحية فقط. قم بتغيير المحاور إلى FSC-H مقابل FSC-A. ارسم مضلعا للبوابة لخلايا مفردة فقط.
لبوابة دليل التعبير عن الخلايا ، انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة الخلية المفردة لتحديد الخلايا المفردة فقط. قم بتغيير المحاور إلى FSC-A مقابل PE-CF594-A. ارسم بوابة للتعبير عن الخلايا الإرشادية باستخدام أداة المضلع.
انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة الإعداد الأخيرة ، إما خلايا مفردة أو دليل للتعبير عن الخلايا. في حالة إجراء تعداء البلازميد حيث يقوم محرر الإepigenome بتشفير بروتين فلوري أزرق ، أو اندماج BFP ، قم بإنشاء بوابة للخلايا الموجبة BFP لعينات اليوم الثاني. قم بإنشاء بوابة لتعبير المراسل عن طريق رسم BB515-A مقابل FSC-A لتحديد الخلايا السالبة GFP وبوابة لها.
ثم قم بتطبيق هذه البوابة على جميع العينات. بعد الانتهاء من إعداد البوابة ، انقر فوق محرر الجدول في اللوحة العلوية. اسحب المجموعات السكانية للتحليل، مثل الخلايا الموجبة BFP والخلايا السلبية ل GFP.
في لوحة محرر الجدول، انقر على إنشاء جدول وانسخ البيانات قبل لصقها في جدول بيانات لحسابات التسوية. الآن ، اطرح عدد الخلايا السالبة للمراسل ، مثل GFP سالب ، في عينة التحكم من جميع العينات الأخرى. هذا يصحح إسكات الخلفية للمراسل.
في حالة إجراء تعداء ، قسم كل قيمة على النسبة المئوية للخلايا الموجبة BFP المقاسة في اليوم الثاني لتطبيع جميع القيم إلى النسبة المئوية للخلايا الموجبة BFP ، ثم اضرب في 100. ينتج عن هذا القيمة الطبيعية لكفاءة التعدي للخلايا المحررة. ارسم البيانات لإنشاء رسوم بيانية خطية تمثل التغييرات عبر الدورة التدريبية الزمنية لتحرير epigenome.
بالنسبة لجميع تجارب تحرير epigenome ، يوصى بعنصر تحكم في الدليل غير المستهدف لتأكيد أن التغييرات في المواقع المستهدفة ناتجة عن تحرير epigenome بدلا من الإفراط في التعبير أو الارتباط غير المحدد لمحرر epigenome. من المهم مراعاة طريقة تسليم محرر epigenome. قد يفضل تعداء الحمض النووي البلازميد أو نواة الحمض النووي الريبي المرسال بالنظر إلى السياق التجريبي.
قد يؤثر النظر في نوع الخلية والجدول الزمني التجريبي وقراءة التسليم وفعالية التسليم على طريقة التسليم المفضلة. تشير الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية من BFP بعد يومين من التعدي إلى تعداء ناجح مع محرر epigenome. يظهر كل من CRISPRoff و CRISPRi ذروة إسكات الجين في اليوم الخامس بعد التعدي.
في تجارب نواة الحمض النووي الريبي المرسال ، لوحظ إسكات جيني قوي في اليوم الثالث بعد النواة باستخدام CRISPRoff.
