يوفر هذا البروتوكول نهجا موحدا لتصوير وتحديد التغييرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا عبر أنسجة متعددة. في أناقة C ، غالبا ما يرتبط مورفولوجيا الميتوكوندريا بوظائفها. يمكن ملاحظة التغييرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا في ظل ظروف مرضية مختلفة ومع تطور الشيخوخة ، والتي غالبا ما ترتبط بخلل في وظيفة الميتوكوندريا ، والأنسجة المختلفة ، ورؤية الأناقة.
إظهار هياكل الميتوكوندريا الفريدة التي تتطلب استراتيجيات تصوير متميزة. لذلك ، يعد اختيار المجهر المناسب وتحسين تحضير العينة أمرا ضروريا لتصوير الأنسجة الناجحة للميتوكوندريا و C Elegance. هنا اخترنا استخدام سلالات السيلية المعدلة وراثيا التي تعبر عن الميتوكوندريا المترجمة GFP بدلا من أصباغ الميتوكوندريا التقليدية.
هذا يسمح لنا بتجنب التأثيرات المستهدفة ، والاختراق الثنائي اللمسي ، وخطوات تحضير العينة المعقدة اللازمة لتصور الميتوكوندريا في الأنسجة المختلفة باستخدام صبغة. ينصب التركيز الأساسي لمختبرنا على دراسة توازن الميتوكوندريا أثناء الإجهاد والشيخوخة. يعد توحيد بروتوكول تصوير الميتوكوندريا أمرا ضروريا لتقليل الأخطاء الإضافية وتوليد نتائج قابلة للتكرار فيما يتعلق بالتغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا في ظل ظروف بيولوجية مختلفة.
للبدء ، احصل على شرائح زجاجية نظيفة. لتحضير العينة ، أضف 10 إلى 20 ميكرولترا من محلول M تسعة على الشريحة الزجاجية وضع العدد المطلوب من الديدان البالغة في أعمار محددة في المحلول. على الشريحة ، قم بتغطية الديدان في محلول M nine بغطاء زجاجي لتصوير العضلات.
الميتوكوندريا ، دفع زلة الغطاء لدحرجة الديدان. ثم باستخدام طلاء الأظافر ، قم بإغلاق جوانب زجاج الغطاء لمنع تبخر محلول M تسعة. استخدم مجهرا قياسيا واسع المجال لتصوير الميتوكوندريا العضلية والبشرة التي تعبر عن علامات الفلورسنت.
استخدم مجهر متحد البؤر لتصوير الميتوكوندريا المعوية وقم بتحسين إعدادات التصوير لتناسب الإعداد التجريبي المحدد. لبدء التحليل ، افتح تطبيق Fiji بعد التثبيت لتنزيل وتثبيت ماكرو mito mapper. أولا ، قم بتنزيل الكود المصدري الأول.
انسخ الكود المدرج ضمن كود IJM لمخطط MIT 1.0. افتح فيجي ، وانتقل إلى المكونات الإضافية ، متبوعا بلصق الكود المنسوخ الجديد والماكرو في نافذة الماكرو. ثم احفظ الماكرو لاستخدامه في المستقبل عبر الملف واحفظه باسم.
انتقل إلى ملف ، ثم افتح لفتح صورة مجهرية ثلاثية الأبعاد باستخدام Zs.In فيجي ، وقم بإنشاء إسقاط أقصى تحت الصورة ، متبوعا بمكدسات ومشروع Z. حدد نطاق الشرائح داخل الصور في التركيز البؤري للحصول على أقصى عرض واختر الحد الأقصى للكثافة كنوع العرض لحفظ الصورة القصوى المعروضة. بصفتك tiff ، انتقل إلى ملف وانقر فوق حفظ متبوعا ب tiff.
قم بقص مناطق الاهتمام من الصورة الكاملة باستخدام أداة المستطيل وانتقل إلى الصورة والاقتصاص. انتقل إلى الملف متبوعا بحفظ باسم و tiff لحفظ صورة الاقتصاص بتنسيق Tiff. قم بسحب وإسقاط خريطة ميتو أو ملف الماكرو المحفوظ مسبقا على شريط أدوات فيجي.
انقر فوق تشغيل. عند المطالبة، حدد المجلد الذي يحتوي على ملف TIFF المحفوظ في الخطوة السابقة. عندما يطلب منك تحديد منطقة، قم بإنشاء مستطيل في الصورة باستخدام أداة المستطيل واضغط على موافق للتأكيد.
أخيرا ، انتقل إلى الملف واحفظ البيانات مع جميع القيم المتعلقة بمورفولوجيا الميتوكوندريا كملف CSV نقطي. كان مورفولوجيا الميتوكوندريا عبارة عن أنسجة محددة مع محاذاة الميتوكوندريا الأنبوبية مع ألياف العضلات في العضلات المترابطة ، والهياكل الشبيهة بالويب في الأمعاء ، وأكثر تقريبا أو بيضاوية. حسنت الميتوكوندريا في تصوير تحت الجلد باستخدام مجهر متحد البؤر تصور الميتوكوندريا المعوية عن طريق تقليل الضوء خارج التركيز مقارنة بالفحص المجهري المركب.
على الشرائح ، عرضت الميتوكوندريا تجزئة بعد 30 دقيقة في المخزن المؤقت M 9 مع ظهور الميتوكوندريا البشروية الأبرز. أدت الشيخوخة إلى تجزئة الميتوكوندريا في جميع الأنسجة التي تظهر على شكل هياكل مقطوعة وكروية. أشار القياس الكمي لرسم الخرائط في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا إلى أن طول الجسم تغير في العضلات وأن نقطة التقاطع تغيرت في تحت الجلد.
