تعد الدراسات الهيكلية للبروتينات المتفاعلة مع الأنابيب الدقيقة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد ضرورية لفهم الآليات الخلوية. يعد تحضير الأنابيب الدقيقة المتجانسة المرتبطة بالبروتينات المتفاعلة على شبكة cryo-EM أمرا بالغ الأهمية للنجاح. هذا البروتوكول بسيط ورخيص ، ويسمح بإعداد الأنابيب الدقيقة مع تعديلات ما بعد الترجمة الخاضعة للرقابة بكمية ونوعية كافية للمجهر الإلكتروني بالتبريد.
الأنابيب الدقيقة حساسة للغاية لدرجة الحرارة. لذلك من المهم الحفاظ على دفء المحاليل المحتوية على الأنابيب الدقيقة لمنع إزالة البلمرة. للبدء ، يتم زراعة خط خلية HCT116 المعدل وراثيا في وسط زراعة الخلايا DMEM حتى يتم الحصول على ستة إلى 12 لوحة متقاربة.
اغسل الخلايا برفق باستخدام 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لإزالة أي وسط لزراعة الخلايا. افصل الخلايا عن الصفائح عن طريق احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد متضاف بخمسة مليمولار EDTA ، وبعد ذلك باستخدام مكشطة خلوية. اجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 ملليلتر على الثلج وقم بتدويرها عند 250 جم لمدة 10 دقائق.
لاحظ حجم الخلايا المحصودة بالمقياس الحجمي على الأنبوب. إعادة تعليق بيليه الخلية المحصودة في حجم متساو من المخزن المؤقت للتحلل وخلايا التحلل عن طريق الصوتنة. بعد الصوتنة ، لتحليل SDS-PAGE ، أضف ميكرولتر من المحللة في أنبوب يحتوي على 18 ميكرولتر من الماء وخمسة ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة 5X SDS.
ماصة الخلايا المحللة المتبقية في أنبوب طرد مركزي وتدور عند 100،000 غرام لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في دوار الطرد المركزي الفائق لمسح المحلل. باستخدام حقنة ، قم بإزالة المحللة التي تم تطهيرها دون إزعاج الحبيبات والطبقة العائمة في الأعلى. أضف ميكرولتر من المحللة التي تم تطهيرها في أنبوب يحتوي على 18 ميكرولترا من الماء وخمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت لعينة 5X SDS.
اشطف الحبيبات بعناية واغرف القليل من الحبيبات عن طريق تحريك طرف ماصة P-10 عبر الحبيبة. ثم أضف 200 ميكرولتر من الماء و 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت SDS. أضف واحد مليمولار GTP و 20 ميكرومولار باكليتاكسيل في طاف مجمع لبلمرة الأنابيب الدقيقة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للأنابيب الدقيقة بالتجمع.
تحضير العازلة وسادة عن طريق إضافة 600 ميكرولتر من الجلسرين إلى 400 ميكرولتر من العازلة تحلل وتكملة الخليط مع 20 ميكرومولار باكليتاكسيل. سخن المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية. أضف 800 ميكرولتر من العازلة للوسادة إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق.
بعد ذلك ، ماصة المحللة المكملة ب GTP-paclitaxel بعناية أعلى المخزن المؤقت للوسادة. ضع الأنبوب في دوار جهاز طرد مركزي فائق الدوران عند 100،000 جم عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ضع علامة على الحافة المواجهة للخارج للأنبوب للتعرف بسهولة على المكان الذي يجب أن تتشكل فيه حبيبات الأنابيب الدقيقة.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المخزن المؤقت للوسادة بعناية باستخدام ماصة دون إزعاج الحبيبات. أضف بعناية محلول التحلل بجوار الحبيبات ، وقم بتدوير الأنبوب عدة مرات لإزالة أكبر قدر ممكن من الجلسرين من الحبيبات وجدران الأنبوب ، ثم نضح وكرر خطوة الغسيل ثلاث مرات. أعد تعليق الحبيبات المغسولة برفق بطرف مقطوع في 50 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق المسخن مسبقا وضع الأنبوب عند 37 درجة مئوية.
أضف ميكرولتر من جزء الحبيبات المعاد تعليقه في 18 ميكرولترا من الماء وخمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت لعينة 5X SDS. قم بإعداد جهاز الفريزر الغاطس عن طريق تثبيت ورق النشاف. اضبط درجة حرارة الجهاز على 30 درجة مئوية والترطيب على 100٪ اسمح للجهاز بالتوازن لمدة 30 دقيقة.
قم بإعداد إعدادات الفريزر الغاطس لتطبيقين. بالنسبة للتطبيق الأول ، اضبط القوة على 10 ، وثانيتين من وقت اللطخة ، ووقت انتظار صفر ثانية. بالنسبة للتطبيق الثاني ، اضبط القوة على 10 و 6.5 ثانية من وقت اللطخة و 10 ثوان من وقت الانتظار.
ضع الشبكات مع جانبها الكربوني لأعلى في مركبة تفريغ التوهج المعدني. يتوهج تفريغ المجهر الإلكتروني المبرد ، أو شبكات EM ، عند 30 مللي أمبير لمدة 60 ثانية. قم بتبريد مجموعة حاوية البوليسترين بالنيتروجين السائل وقم بإعداد الإيثان السائل في كوب معدني عن طريق تكثيف غاز الإيثان في كوب معدني بارد.
قم بتخفيف البروتين المتفاعل مع الأنابيب الدقيقة بحجم متساو مع محلول التخفيف قبل تطبيقه على الشبكات لخفض تركيز الخلية. ضع الخلاط على حرارة 37 درجة مئوية. استخدم كتلة معدنية دافئة في صندوق بوليسترين عازل إذا لم يكن هناك كتلة تسخين بالقرب من جهاز تجميد الغطس.
احصل على شبكة مفرغة متوهجة باستخدام ملاقط الغطس وانقر عليها في الفريزر المغطس. ضع حاوية البوليسترين مع الإيثان السائل في الفريزر المغرق وقم بتشغيلها من خلال البرنامج المعد. أولا ، ضع 3.5 ميكرولتر من محلول الأنابيب الدقيقة على الشبكة.
دع الفريزر يغرق لطخة الشبكة. ثم ، على الفور تطبيق 3.5 ميكرولتر من البروتين المخفف. وأخيرا ، دع المكبس يمسح ويغرق في تجميد الشبكة في الإيثان السائل.
نقل الشبكات إلى صندوق تخزين الشبكة وتخزينها في ديوار النيتروجين السائل حتى التصوير. تم تقييم جودة وتركيز الأنابيب الدقيقة المستخرجة بواسطة جل SDS المصبوغ ب Coomassie. يشير خط الانحدار غير الخطي لكميات BSA النسبية ، المشتقة من استيفاء نطاق الأنابيب الدقيقة حوالي 50 كيلو دالتون في حارة P2 مع منحنى BSA ، إلى تركيز نهائي قدره 1.42 ملليغرام لكل ملليلتر.
هذا يتفق بشكل جيد مع الرقم المقاس باستخدام مقياس الطيف الضوئي بواسطة شخصين. تم استخدام الأنابيب الدقيقة المستخرجة حديثا لصنع عينات cryo-EM. تبدو الأنابيب الدقيقة سليمة وفيرة على الصور المجهرية.
يجب ألا تكون كثافة الأنابيب الدقيقة لكل صورة مجهرية عالية جدا لتجنب عبور الأنابيب الدقيقة بعضها فوق بعض. تشير الأنابيب الدقيقة المكسورة إلى أن الأنابيب الدقيقة منزوع البلمرة ، أو أن تركيز الأنابيب الدقيقة كان كثيفا جدا. كانت الأنابيب الدقيقة المرتبطة ب MATCAP ذات حواف خشنة تتميز بنقاط كثيفة الإلكترون على سطح الأنابيب الدقيقة.
يمكن أيضا تمييز الأنابيب الدقيقة المرتبطة ب MATCAP و MATCAP غير المنضمة في فئات 2D المحسوبة. يمكن أن يسمح صنع شبكات cryo-EM بهذه الطريقة بدراسة بنية الأنابيب الدقيقة المرتبطة ببروتين متفاعل معين. هذا يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات في بيولوجيا الخلية الهيكلية.
