تعطي الاستجابات العصبية نظرة ثاقبة لنشاط الدماغ ، ولكن يمكن أن تختلف عبر التجارب والأفراد. يساعد هذا البروتوكول من خلال أتمتة تسجيل وتحليل التحفيز ، وتبسيط برمجة أنواع وأنماط مختلفة من المحفزات. تسمح التقنية الآلية بتسجيلات العديد من الخلايا العصبية والكائنات الحية في نفس تنسيق الموائع الدقيقة بالتوازي.
هذا يحسن تكرار التسجيلات ويسمح باستكشاف التباين العصبي عبر السكان. هناك حاجة إلى أنماط تحفيز مختلفة للكشف عن الظواهر العصبية مثل التكيف والتكامل الحسي. هذه الطريقة قابلة للتعميم على الإشارات الديناميكية الأخرى من الخلايا والكائنات العضوية إلى الكائنات الحية والنباتات.
للبدء ، قم بتشغيل المجهر ، واملأ وإزالة فقاعات الهواء من أنبوب الخزان باستخدام حقنة التحضير ، ثم املأ أنبوب التدفق الخارجي بمحلول مؤقت. قم بإزالة جهاز الموائع الدقيقة من مجفف الفراغ. ضع الجهاز على المجهر وأدخل أنبوب المخرج بسرعة.
اضغط برفق على حقنة المخرج لحقن السائل في الجهاز حتى تخرج قطرة من المدخل. عند مدخل القطرة هذا ، استخدم وصلة قطرة إلى إسقاط لإدخال أنبوب مدخل السوائل المقابل ، مما يضمن وجود قطرات سائلة على كل من أنبوب المدخل وفتحة الجهاز لتجنب إدخال فقاعة. قم بتوصيل أنبوب المدخل التالي بالقطرة التالية.
احقن المزيد من السوائل من المخرج إذا لزم الأمر وكرر ذلك حتى تمتلئ جميع المداخل. أدخل دبوس حظر صلبا عند المداخل غير المستخدمة ومنفذ تحميل الدودة. تحقق من التدفق على الشاشة للتأكد من أن التدفق يسير في الاتجاه المطلوب.
اقلب الصمام الأول على وحدة التحكم في الصمام وراقب تدفق التحفيز المتدفق إلى ساحة الموائع الدقيقة. إذا كان التدفق غير متوازن ، فاضبط ارتفاعات الخزان. انقل الحيوانات البالغة الصغيرة إلى وسط نمو الديدان الخيطية غير المصنف أو صفيحة أجار NGM باستخدام معول طرف سلكي ، ثم اغمر اللوحة بحوالي خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت القاعدي XS بحيث يمكن للحيوانات السباحة.
ارسم الديدان في حقنة تحميل من واحد إلى ثلاثة ملليلتر باستخدام الأنبوب المرفق المملوء مسبقا بمخزن مؤقت قاعدي XS. باستخدام مجسم، حرك الأنبوب أسفل سطح السائل بيد واحدة لكل مرغوب فيه واسحبه إلى الأنبوب باستخدام المحقنة الموجودة في اليد الأخرى. أغلق مخطط المخرج ، وقم بإزالة دبوس تحميل الفيروس المتنقل ، وقم بتوصيل حقنة تحميل الفيروس المتنقل بالجهاز باستخدام اتصال إسقاط إلى إفلات.
ثم تدفق الحيوانات بلطف إلى الساحة. إنشاء تدفق المخزن المؤقت والسماح لمدة تصل إلى ساعة واحدة للشلل بواسطة tetramisole. باستخدام محرر النصوص ، قم بإنشاء ملف نصي لتعريف التحفيز باسم userdefinedacquisitionsettings.
txt يحتوي على إعدادات التحفيز للحصول التلقائي على الصور. يحدد هذا الملف معلمات اكتساب المجهر مثل توقيت التعرض والإثارة، ومدة المحاكمة، والفواصل الزمنية، وحفظ الدليل. كما يحدد نوع التجربة وإعدادات توقيت التحفيز.
لتجربة تحفيز واحدة ، استخدم تنسيقا به أمر تحفيز متكرر واحد فقط. لتجربة متعددة الأنماط، استخدم تنسيقا مع أوامر تحفيز متعددة عن طريق تضمين تسلسل نمطي من الأرقام يمثل ترتيب أنماط التحفيز. لكل نمط ، أدخل أمر تحفيز في سطر منفصل.
بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج التحكم المجهري. تحقق من أن جميع مداخل السوائل مفتوحة ، وأن التدفق مرغوب فيه داخل الساحة ، وأن الخلايا العصبية ذات الاهتمام في بؤرة التركيز داخل النافذة الحية. ثم أغلق النافذة الحية وقم بتشغيل البرنامج النصي multipatternrunscript.
BSH داخل البرنامج. لتحليل البيانات ، قم بتشغيل NeuroTracker بالنقر بالتتابع على المكونات الإضافية ، ثم التتبع ثم NeuroTracker. حدد المجلد الذي يحتوي على ملفات فيديو tiff المراد تعقبها وحدد نطاق الملفات المراد معالجتها.
بعد ذلك ، باستخدام الصورة وضبط القوائم ، افتح نوافذ تباين السطوع والتحكم في العتبة. تحقق من الخلفية المظلمة ولا تقم بإعادة تعيين النطاق في نافذة العتبة ، مع تعيين طريقة الحد الأدنى إلى الافتراضي والمرئيات إلى اللون الأحمر. ثم انقر فوق تلقائي في نافذة تباين السطوع لرؤية الخلايا العصبية.
في نافذة تباين السطوع ، اضبط منزلقات الحد الأدنى والحد الأقصى حتى يمكن تمييز الخلايا العصبية بوضوح. ثم اضبط مستوى العتبة حتى تظهر جميع الخلايا العصبية كبقع حمراء صغيرة منفصلة عن الكائنات الأخرى. اضبط منزلق الإطار لمراقبة حركة الخلايا العصبية وتغيرات شدتها، مع ملاحظة أي يجب استبعادها من التتبع، مثل التداخل مع الحيوانات الأخرى.
بعد تحديد الخلايا العصبية للتتبع ، اضبط مستوى العتبة لكل إذا لزم الأمر ، بحيث تكون منطقة العتبة الحمراء فوق الخلية العصبية مرئية في كل إطار. انقر على الخلية العصبية لتسجيل موقعها ومستوى العتبة. عند تحديد جميع الخلايا العصبية ، اضغط على شريط المسافة لبدء التتبع.
مراقبة عملية التتبع لكل وإجراء أي تصحيحات ضرورية. إذا توقف NeuroTracker مؤقتا ، فقد الخلية العصبية. اضبط مستوى العتبة حسب الحاجة وأعد النقر فوق الخلية العصبية.
إذا قفز مربع التكامل إلى آخر قريب أو بنية غير عصبية ، فاضغط على شريط المسافة للتوقف مؤقتا. حرك شريط التمرير مرة أخرى إلى الإطار الخاطئ الأول وأعد النقر فوق موقع الخلية العصبية الصحيح. قم بتشغيل الملخص العصبيpdf.
m في MATLAB وحدد المجلد الذي يحتوي على ملفات بيانات NeuroTracker النصية. انتظر حتى يتم إنشاء ملف PDF موجز ، مما يسمح بالتحقق من عملية التتبع. يمكن التعرف على الحيوانات من خلال الأرقام والاستجابات العصبية من كل وتجربتها وعرضها لتقييم التباين السكاني.
استخدم الدالة DataBrowse. م لاستكشاف البيانات العصبية المجمعة حسب رقم التجربة أو رقم الحيوان أو نمط التحفيز أو حسب فئة أخرى. تم اختبار ظاهرة التثبيط الزمني في تجربة نبضة مزدوجة أنتجت ثمانية أنماط تتكون من نبضتين رائحتين مدة كل منهما ثانية واحدة مفصولة بفاصل زمني يتراوح من صفر إلى 20 ثانية.
أثارت نبضة الرائحة الأولى التي تبلغ مدتها ثانية واحدة حجم استجابة متساو في ثنائي الأسيتيل الذي يكتشف الخلايا العصبية AWA وتختلف الاستجابات في النبضة الثانية مع فترة التحفيز البيني. تم تقييم إزالة التثبيط من خلال تجربة المصيد حيث لوحظ التكيف مع محفز ثنائي الأسيتيل ، لكن عرض التحفيز الجديد 2-methylpyrazine لم يثر تأثيرا قويا لإزالة التثبيط. كشف التحفيز متعدد الوسائط الذي تم اختباره أن التحفيز الكيميائي وحده تسبب في التكيف بينما التحفيز البصري وحده لم يفعل ذلك.
غير أن نمط التحفيز المتعدد الوسائط المشترك أظهر أن الاستجابات البصرية كانت عرضة للتكيف المستحث كيميائيا. من خلال تعديل تصميم الموائع الدقيقة ليشمل مجالين ، يمكننا مقارنة الاضطرابات الجينية أو غيرها جنبا إلى جنب مع مرجع مطابق في نفس الوقت. بمجرد الإعداد ، يمكن تعديل النظام بعدة طرق.
على سبيل المثال ، قمنا تلقائيا بقياس استجابات الجرعة الكيميائية والتغيرات المعتمدة على الحالة في النشاط العصبي مثل بين حالات النوم والاستيقاظ.
