يتيح التألق المناعي LC3 تحديد مستويات الالتهام الذاتي في خلايا البنكرياس. يسمح بدراسة الآثار المحتملة للعوامل المختلفة على الالتهام الذاتي لخلايا البنكرياس. التألق المناعي هو تقنية تستخدم للكشف عن بروتين LC3 الداخلي ، والذي يتجنب المشاكل الناجمة عن الإفراط في التعبير عن LC3 ، مثل تكوين مجاميع البروتين غير المرتبطة بالالتهام الذاتي.
وسيظهر الإجراء فيليبي رينا، خريج الدكتوراه، ومالينا هيريرا لوبيز، طالبة دكتوراه من مختبر ماريا إينيس فاكارو. لبدء تحضير الخلية ، انقع غطاء دائري 12 ملم في الإيثانول المطلق. بعد إزالة الغطاء ، ضع الغطاء المنقوع عموديا في اللوحة المكونة من 24 بئرا.
قم بتعريض اللوحة متعددة الآبار للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. ثم ضع الغطاء أفقيا واغسله باستخدام DMEM. انظر الآن إلى انخفاض عدد خلايا البنكرياس ، التي أعيد تعليقها في DMEM ، والتي تحتوي على 10٪ FBS والبنسلين والستربتومايسين ، واحتضان الخلايا لمدة يومين.
بعد يومين من بذر الخلايا ، قم بإعداد محلول gemcitabine في DMEM بتركيز ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر. ثم نضح نصف الحجم من كل بئر في أنبوب منفصل ، وأضف كمية مناسبة من محلول gemcitabine. أعد نصف الحجم المقابل لكل بئر مرة أخرى إلى الآبار المعالجة ، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة.
لتثبيت الخلايا ونفاذها ، أضف الميثانول البارد إلى صفيحة تحتوي على خلايا مكونة من 24 بئرا. أيضا إعداد لوحة ستة بئر مع برنامج تلفزيوني بارد. باستخدام إبرة حقنة وملاقط ، خذ كل زلة غطاء واغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني.
ثم احتضان في الميثانول لمدة ست دقائق. بعد الغسيل مرتين باستخدام PBS ، احتضان انزلاق الغطاء في محلول مانع لمدة ساعة واحدة. أضف مضاد LC3 في محلول الحجب بنسبة واحد إلى 1000 ، واحتفظ به على الجليد.
ضع قطعة من فيلم الختم المختبري فوق الغطاء متعدد الآبار ، وأضف 25 ميكرولترا من محلول مضاد LC3 لكل انزلاق غطاء فوق فيلم الختم. باستخدام إبرة حقنة وملاقط ، ضع كل غطاء ينزلق فوق قطرة الجسم المضاد الأولية ، مع التأكد من أن جانب الخلية ملامس للمحلول. ضع اللوحة متعددة الآبار في غرفة الرطوبة.
غطيها بورق احباط واحتضانها طوال الليل في الثلاجة. في اليوم التالي ، قم بإزالة اللوحة متعددة الآبار من غرفة الرطوبة. ضع الغطاء ينزلق مرة أخرى على اللوحة متعددة الآبار واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
تمييع مكافحة الأرانب المسمى الفلورسنت في محلول مانع بنسبة واحد إلى 800 ، والحفاظ على الجليد في الظلام. بعد إغلاق الغطاء متعدد الآبار ، أضف 25 ميكرولترا من المحلول المضاد للأرانب لكل انزلاق غطاء فوق فيلم الختم. وعالج انزلاق الغطاء بجسم مضاد ثانوي كما هو موضح سابقا.
ثم احتضان اللوحة في غرفة الرطوبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة بالأجسام المضادة ، اغسل انزلاق الغطاء على اللوحة متعددة الآبار باستخدام PBS ثلاث مرات. احتضن كل زلة غطاء بمحلول DAPI المحضر لمدة 10 دقائق.
بمجرد غسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ، حافظ على اللوحة متعددة الآبار في الظلام. لمونتاج الخلية ، قم بإعداد كأسين بالماء وقطعة من الورق. أضف 10 ميكرولتر من محلول PVA-DABCO لكل غطاء منزلق على شريحة.
اغسل الغطاء في الماء ، ثم جففه على الورق. أخيرا ، ضعه فوق قطرة PVA-DABCO. وتجف بين عشية وضحاها في الظلام.
في اليوم التالي ، باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب ، تصور الخلايا المسماة والتقاط الصور. بعد التقاط الصور ، اسحب وأفلت كل ملف صورة يحتوي على القنوات الملتقطة في شاشة فيجي. في مربع الحوار، انقر فوق موافق لفتح الصورة.
ثم أغلق نافذة وحدة التحكم المفتوحة. من علامة التبويب صورة، حدد اللون، ثم تقسيم القنوات. أغلق الصورة المقابلة للقنوات الأخرى غير صورة LC3.
ثم في علامة التبويب صورة ، حدد ضبط ، متبوعا بتوازن اللون. حرك شريط التمرير الأقصى إلى اليسار حتى تتشبع الصورة لتصور ملامح الخلية. استخدم أداة التحديد اليدوي لرسم حدود الخلية، وانقر إعادة تعيين لضبط الألوان.
لقص العنصر المحدد من علامة التبويب تحرير، حدد قص، وأغلق الصورة بدون حفظها. ومن علامة التبويب تحرير ، حدد لصق. في القائمة تحليل ، اختر الأداة 3D Objects Counter.
اضبط الحد الأدنى على 2000 ، ومرشح الحجم على 50 إلى 500. تأكد من وضع علامة على الكائنات ومربعات الملخص ، وانقر فوق OK.In نافذة السجل ، وسيتم وصف عدد النقاط على أنها كائنات تم اكتشافها. أشار التألق المناعي إلى التوزيع الخلوي لبروتين LC3 ، بينما أظهر DAPI توطينا نوويا في خلايا البنكرياس.
زادت نقاط LC3 بشكل ملحوظ تحت علاج gemcitabine ، مما يشير إلى نشاط الالتهام الذاتي. في ظل الالتقاء المفرط ، تميل خلايا البنكرياس الخارجية الإفراز إلى التراكم والنمو فوق بعضها البعض. كانت طريقة تثبيت خلايا بارافورمالدهايد غير فعالة للحفاظ على بروتينات LC3 ، لأنها لا تعكس التوزيع الدقيق.
عندما تم إجراء التثبيت أو العلاج دون الانتظار يومين بعد البذر ، كان لخلايا PANC1 شكل دائري. قلل هذا التشكل من العلاقة بين السيتوبلازم والنواة ، مما يجعل من الصعب فهم التوزيع داخل الخلايا ل LC3. يمكن أن يتداخل التثبيت غير المكتمل للميثانول مع وضع العلامات المناعية المناسبة ل LC3 ، مما يؤدي إلى صور غير واضحة وتقدير كمي دون المستوى الأمثل.
أهم شيء يجب تذكره خلال هذا الإجراء هو أنه يجب تثبيت الخلايا في الميثانول البارد لمدة ست دقائق ، بدلا من بارافورمالدهيد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحليل التمركز المشترك بين LC3 والبروتينات الأخرى ، مما يسمح بدراسة المسارات الجزيئية المختلفة المتعلقة بوظائف LC3.
