هذا البروتوكول هو الأول الذي يصف كيفية معالجة وتقييم حجم الماوس لأمراض RP باستخدام إلكترون انتقال الضوء والمجهر متحد البؤر. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي إدراج التقييمات الكمية لأمراض RP ، باستخدام تقنيات التصوير الثلاثة هذه للمقارنات الإحصائية. قد تساعد التقنيات الموضحة في هذا البروتوكول أيضا في توسيع معرفتنا بالمسارات الجزيئية المهمة لصحة RPE.
قد يعاني الأفراد الذين لم يسبق لهم تشريح حجم الماوس مع هذا البروتوكول. نقترح أن يتدرب هؤلاء الأفراد مع بعض الفئران لإتقان التقنيات الموضحة في هذا البروتوكول. للبدء ، قم بإعداد نظام تروية تغذية الجاذبية على وسادة سفلية ماصة للتروية القلبية في غطاء الدخان.
صب 40 ملليلتر من العازلة المثبتة الطازجة في برميل حقنة لنظام التروية. أدر الصمام موازيا لخط الأنبوب للسماح للمخزن المؤقت بالتدفق عبر خط الأنبوب. اغسل الخط حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء من الخط.
ثم أدر الصمام عموديا على خط الأنبوب لمنع المخزن المؤقت من التدفق إلى خط الأنبوب. لإجراء التروية القلبية ، انقل الماوس الرحيم إلى صينية ضحلة بالقرب من نظام التروية. مع توجيه البطن لأعلى.
رش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم قم بإنشاء قطع أدنى بمقدار خمسة سنتيمترات باستخدام مقص وملقط منحني عبر الجلد وجدار البطن على الجانب الأيسر من الماوس أسفل القفص الصدري. المضي قدما في جعل قطع الإنسي ثلاثة سنتيمترات من خلال الجلد وجدار البطن في الجزء العلوي من قطع أدنى. قم بعمل قطع آخر أقل شأنا بمقدار خمسة سنتيمترات في نهاية القطع الإنسي عبر الجلد وجدار البطن على الجانب الأيمن الأبعد من الماوس أسفل القفص الصدري.
قم بعمل شق وسطي آخر بطول ثلاثة سنتيمترات لإزالة رفرف جلد البطن بالملقط المنحني. بعد ذلك ، قم بقطع الحجاب الحاجز والقص لفضح القلب. أدخل إبرة القياس في البطين الأيسر للقلب وأدر الصمام.
اقطع الأذين الأيمن بمقص منحني للسماح للدم والمثبت بالخروج من القلب. اترك 10 ملليلتر من المخزن المؤقت المثبت لتخلل الفأر لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، أو حتى يصبح لون الكبد شاحبا ولا يتدفق الدم من الأذين الأيمن. بمجرد اكتمال التروية ، أدر الصمام عموديا على خط الأنبوب لإيقاف تدفق المخزن المؤقت.
لنواة العينين ، قم بإزالة الماوس من الدرج الضحل وضعه على الوسادة السفلية الماصة في غطاء الدخان. ثم قم بتوجيه رأس الماوس بحيث تواجه العين اليسرى المجرب والعين اليمنى بعيدا عن الأنظار. قم بالتعليق على الجانب العلوي من العين باستخدام صبغة وسم الأنسجة.
ادفع برفق لأسفل حول محجر العين بالإبهام والسبابة لبروز العين من محجر العين. ثم باستخدام مقص منحني ، أمسك العين بالشفرة بزاوية 30 درجة من مقبس العين واقطعها حول العين. أخرج مقلة العين من الرأس بالملقط المنحني وضعها على وسادة سفلية ماصة.
قم بشق القرنية بشفرة مشرط رقم 11 وضع العين بملقط منحني في أنبوب دقيق سعة 2 ملليلتر يحتوي على ملليلتر من المخزن المؤقت المثبت. بعد نواة كلتا العينين ، احتضنهما في مخزن مؤقت مثبت طوال الليل على شاكر في غرفة أربع درجات بسرعة 75 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، استبدل المخزن المؤقت المثبت بملليلتر من PBS واحتضانه لمدة 10 دقائق على شاكر في درجة حرارة الغرفة و 75 دورة في الدقيقة.
بجانب توليد شرائح خلفية ، ضع العين في طبق بتري مملوء ب PBS تحت مجهر تشريح. ارفع أي دهون وعضلات برفق بعيدا عن مقلة العين باستخدام ملقط رفيع. تقليم الدهون والعضلات بعناية باستخدام مقص تشريح دقيق في اتجاه مواز لمقلة العين حتى يكون لمقلة العين لون أسود مزرق موحد ضع ملقط رفيع في موقع ثقب القرنية واقطع حول محيط القرنية بدءا من موقع البزل بمقص تشريح دقيق لإزالة القرنية والقزحية من مقلة العين.
ثم باستخدام ملقط رفيع ، قم بإزالة العدسة برفق من مقلة العين للحصول على الجزء الخلفي. ضع الجزء الخلفي في أنبوب يحتوي على ملليلتر PBS ، واحفظه في أربع درجات مئوية في الثلاجة حتى الاستخدام. نقل العين إلى طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني وإزالة القرنية والقزحية كما هو موضح.
اسحب العدسة بملقط رفيع. ثم باستخدام ملقطين رفيعين ، افصل الشبكية العصبية برفق عن الجزء الخلفي. قطع بعناية شبكية العين العصبية في رأس العصب البصري لإزالتها من كأس العين الخلفية.
ضع كوب العين في أنبوب صغير سعة 2 ملليلتر يحتوي على خمسة ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. لإصلاح أكواب العين الخلفية ، أضف 500 ميكرولتر من الميثانول إلى الأنسجة واحتضانها على شاكر عند 75 دورة في الدقيقة ، لمدة خمس دقائق. كرر تثبيت الميثانول ثلاث مرات مع الحضانة النهائية لمدة ساعتين.
بعد التثبيت ، اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، قبل الشروع في تلطيخ التألق المناعي والتصور من خلال الفحص المجهري متحد البؤر. أظهرت فئران TMEM 135 TG البالغة من العمر أربعة أشهر انخفاضا كبيرا في ظهارة الشبكية المصطبغة أو سمك RPE عند 600 و 900 ميكرومتر بعيدا عن العصب البصري ، مقارنة بالفئران البرية المطابقة للعمر. تم حساب حوادث أمراض RPE بما في ذلك الأوعية الدقيقة ، والفراغ الكبير وهجرة الفئران WT و TMEM 135 TG البالغة من العمر 325 يوما.
كان متوسط تواتر الفراغ الدقيق RPE أقل في النوع البري مقارنة بفئران TMEM 135 TG. لم يتم الكشف عن أي فراغ كرو RPE وهجرة في النوع البري مقارنة بمتوسط القيم التي لوحظت في الفئران TMEM 135 TG. في المجهر الإلكتروني النافذ ، لوحظت رواسب رقائقية قاعدية في شبكية العين البالغة من العمر 24 شهرا والتي كانت غائبة في شبكية العين البالغة من العمر شهرين.
أشار تحليل الترددات التراكمية لارتفاعات الرواسب الصفحية القاعدية إلى تحول إلى يمين الخط لعمر 24 شهرا ، مقارنة بعمر شهرين ، مما يدل على زيادة في الرواسب في الفئران البالغة من العمر 24 شهرا. تم دعم هذه الملاحظة من خلال متوسط ارتفاعات أكبر في شبكية العين البالغة من العمر 24 شهرا. كان RPE في الفئران TMEM 135 TG البالغة من العمر أربعة أشهر مشوها.
RPE في شبكية العين TMEM 135 TG أكبر وأقل كثافة من شبكية العين من النوع البري المطابق للعمر. أيضا ، لوحظ المزيد من خلايا RPE متعددة النوى في شبكية TG ، مقارنة بالضوابط. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين تقييم مسارات محددة باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية في الفئران ، مما قد يساهم في فهمنا لكيفية تطور أمراض RP هذه في الفئران.
سيساعد هذا البروتوكول على توحيد التنميط الظاهري RP في الفئران ، والذي سيترجم نتائج دراسات الفئران إلى نماذج AMD الأخرى ويساعد في فهمنا لعلم الأحياء المرضي AMD.
