ثقافة أولية منخفضة الكثافة سهلة وقابلة للتكرار باستخدام مخزون مجمد من الخلايا العصبية الجنينية الحصين

المخزونات المجمدة من الخلايا العصبية الجنينية للفئران جاهزة للاستخدام ، ولا يلزم تقنيات متقدمة لزراعة الخلايا. هذه التقنية سهلة للغاية ولا تحتاج إلى أي إذن لإجراء تجارب على الحيوانات أو ترتيب الحيوانات الحامل الموقوتة أو تشريح الأجنة. يمكن استزراع الخلايا العصبية في أوعية استزراع أخرى وتطبيقها في أنواع أخرى من التجارب.

على سبيل المثال ، لوحات صفيف microelectrode للتجارب الكهربية. ابدأ بطلاء صفيحة دقيقة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من بولي-L-ليسين لكل بئر. بعد ذلك ، احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة ، قم بإزالة محلول poly-L-lysine. اغسل الأطباق مرتين بالماء المعقم ومرة واحدة باستخدام وسط زراعة طازج خال من المكملات الغذائية. ضع الأطباق حتى تجف.

يمكن لف الألواح الجافة وتخزينها لمدة تصل إلى شهر واحد عند أربع درجات مئوية. لبدء بذر الخلية ، أضف 50 ميكرولترا من وسط الاستزراع إلى كل بئر في الألواح المطلية. املأ الآبار الطرفية ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم واحتضان اللوحة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قم بإزالة قارورة تبريد الخلايا العصبية من خزان النيتروجين السائل وضعها في كتلة حرارية 37 درجة مئوية لإذابة محتوياتها جزئيا. باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد مع طرف تجويف عريض ، انقل محتويات القوارير ببطء قطرة قطرة إلى أنبوب معقم سعة 50 ملليلتر. شطف قارورة التبريد الفارغة مع واحد ملليلتر من وسط ثقافة درجة حرارة الغرفة.

انقل محلول الشطف إلى الأنبوب سعة 50 ملليلتر الذي يحتوي على معلق الخلية. بعد ذلك ، أضف تسعة ملليلتر من وسط ثقافة درجة حرارة الغرفة بالتنقيط في الأنبوب سعة 50 ملليلترا ، مما يجعل الحجم يصل إلى 11 ملليلتر. بعد عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، انقل تعليق الخلية إلى خزان.

الآن ، باستخدام ماصة متعددة القنوات مع أطراف تجويف عريضة ، قم بتوزيع تعليق الخلية بعدد نهائي يبلغ 1.0 في 10 إلى الخلايا الأربع لكل بئر في اللوحة المطلية المكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا العصبية لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع المسخن مسبقا واحتضانه مرة أخرى في نفس الظروف.

بعد أربعة أيام في المختبر ، أضف السيتوزين بيتا-د-أرابينوفورانوسيد بالتركيز النهائي البالغ 0.2 ميكرومولار لكل بئر لتقليل نمو الخلايا الدبقية. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة. بعد 21 يوما في المختبر ، عالج الخلايا بالأدوية ذات الأهمية.

للحفاظ على تحكم إيجابي ، عالج الخلايا ب 100 غلوتامات ميكرومولار لكل بئر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية قبل التثبيت. قبل إجراء الدراسات المناعية ، قم بإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة عن طريق استبدال محلول الثقافة ب 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد في كل بئر. بعد التثبيت ، اغسل الآبار مرتين ب 250 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات لكل بئر لمدة خمس دقائق لكل بئر.

في الدراسة الحالية ، تم تطوير الخلايا العصبية بشكل طبيعي دون تبادل وسط المزرعة لمدة ثلاثة أسابيع. كشفت الكيمياء الهيستولوجية المناعية عن أشواك تغصنية إيجابية للدريبرين على طول التشعبات الإيجابية MAP2. لوحظ انخفاض يعتمد على الجرعة في كثافات مجموعة دريبرين ضد تحفيز الغلوتامات.

من المهم جدا زرع معلق الخلية قبل أن يصبح دافئا جدا. تعد إضافة وسط الاستزراع بالقطرة أمرا بالغ الأهمية أيضا لتجنب التغيير المفاجئ في الأسمولية.